Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

1. Kültürlü İlköğretim Hipokampal Nöronlar gelen Hedef Protein Ekstraksiyonu Proteaz inhibitörleri ile; primer hipokampal hücrelerinde endojen protein hasat öncesinde, bir Lysis Buffer (Tablo 1 LB) hazırlamak. Lizis tamponu 10 ml, 10 mM bir son konsantrasyon için 0.1 ml çözelti fenilmetansülfonil florür (PMSF) ekleyin ve 1 proteaz önleyici kokteyl tablet ekleyin. Liyofilize toz N-etilmaleimid (NEM) solüsyonu (Tablo 1) hazırlayın. Yavaşça oda sıcaklığında (RT),% 100 EtOH içinde çözülür. Her deney günü taze NEM solüsyon hazırlanır. Sonraki lizis tamponu ve NEM birleştirir. Bir taze 50 ml konik tüpe 2M NEM çözeltinin 0.5 ml ilave edilir. 20 üstünden ml LB, ve hızlı bir şekilde yer LB Ekle 4 bir sallanan bir platform ° C tam 5 dakika boyunca karıştırmak için + NEM (50mM final konsantrasyon). Her zaman düzgün bir şekilde karıştırmak için iki şekilde, NEM / EtOH çözelti birinci ve ikinci LB ekleyin. Inkübatör ve buz * üzerine yerden kültürü nöronlar çıkarın. Yavaşça hücresel ortamı çıkarın ve hafifçe soğuk fosfat ile iki kez yıkayın salin (PBS) 1x tamponlu. Tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı ile hipokampal nöronlar, ve kazıma hücrelerinin birinci oyuğa 300 ml LB + 50 mM NEM ekleyin. Hücre lisatı toplayın, o zaman bu grubun iyi bir sonraki içine lizat deşarj. Hücre kaldırıcı kullanarak iyi ikinci olan hücreleri kazıyın, toplamak ve daha lizat konsantre etmek gerekirse, bir üçüncü de kullanarak tekrarlayın. Bir önceden soğutulmuş (buz üzerinde), 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine hücre lisatı toplayın. Kalan hücre lizat toplamak için LB 100 ul + 50mM NEM kullanarak 1.4 adımı yineleyin. Çözüm içine kabarcıklar darbe için dikkatli olmak, mekanik parçalanma yardımcı olmak için bir 26 ½ göstergesi şırınga 5-6 kez ile total hücre lizatı pas. Ekipman varsa biri yerine, buz üzerinde 15 saniye boyunca sonikasyon yapabilirsiniz. 4 ° C'de 30 dakika süreyle ≥ hücre lisatı Nutate Hücre lysa Açıkladılarte sipariş pelet un-parçalanan hücreler ve deterjan-çözünmeyen malzeme 16,000 xg / 30 dk santrifüj tarafından. Buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş 1.5 ml tüp hücre lizat (süpernatant) temizlenir toplayın. Hücrelerin tüm gruplar için hasat protokolü tekrarlayın. Tedbir protein BCA assay kullanarak tüm lizat örneklerinde konsantrasyon ve 500 mcg, önerilen minimum, tam olarak eşit toplam protein olması hücre gruplarının tüm lizat örneklerin hacim normalleştirmek. Tüm örneklerde LB + 50mM NEM ile 500 ul toplam hacmi kadar ekleyin. Lizat, örneğin her için hedef proteine ​​karşı yöneltilmiş birincil antikor 1-5 ug ekleyin. 4 gecede antikor-lizat karışık numune ° C. Nutate * Birincil fare hipokampal nöronlar bir nöronal B27 eki ihtiva eden bir serumsuz ortam içinde, / iyi bir 6-çanak içinde yaklaşık olarak 250,000 hücrelik bir yoğunlukta kültür az olmalıdır, daha önce arzu 5 için tarif edilmiştir ve yetiştirilend zaman uzunluğu, olgunluk elde etmek için tipik olarak 14-16 gün-in-vitro (DIV). Toplam protein, 500 ug en az başarılı bir şekilde immunoprecipitate ve tipik olarak 6-çanak 2-3 kuyu gerektiren bir hedef nöronal protein, biotinylate tavsiye edilir. 2. Antikor-Bağımlı Hedef Protein yağış Bir hedef protein hızlandırıcı ve hareketsizleştirici önce, protein A veya protein G-Sepharose boncuk kaplı% 50 bulamaç hazırlanır. Özellikle, tüm örnekler boncuk eşit miktarda sahip olmasını sağlamak, 1.5 ml tüpler için örnek başına Sepharose boncuk ≥ 60 ul ekleyin. Donanım mevcut olduğu takdirde manyetik boncuklar da uygundur. Her bir antikor-lisatı numune için en az% 50 bulamaç eşit hacimde bir ekleyin ve 4 ≥ 1 saat boyunca nutate ° C. 3. Açil-Biotin Değişim: Hidroksilamin (HAM) Dilinim Adım 2.2 gerçekleştirirken, di lizis tamponu (LB) ile tüpler bir dizi hazırlamakfferent pH. PH adımları için çok önemlidir ve her zaman bir pH metre kullanılarak ayarlanmalıdır. LB numune başına pH 7,2 ve numune başına Sıkı Tampon (Tablo 1) 0,5 ml 2 ml hazırlayın. Ayrıca adımları 1.1-1.3 olarak, 0.5 ml LB numune başına + 10mM NEM hazırlamak. Adım 1.1 'de olduğu gibi, her lizis tampon ile PMSF ve proteaz inhibitörü tablet ekleyin. Hidroksilamin (HAM) olan bölünme palmitat ve sistein dan biyotinilasyon (Şekil 1) için gerekli olan bir kuvvetli indirgeyici madde, ve HAM bölünme ihmal bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Iki örnek, HAM dilinim adım (-HAM) atlayarak biri ve HAM adım (+ HAM) dahil olmak üzere tek bir boncuk her numune Böl. HAM tedavisi neden protein parçalanması için normalize etmek için, bir-HAM kontrolü için kullanılan boncuk 1/3 ile, üçe bölünmüş her bir numune gerekir, ve geriye kalan 2/3 + HAM tedavi etmek için kullanılır. Ek 1 hazırlayın.Her bir numune için-HAM kontrol olarak etiketlenmiş buz üzerinde 5 ml borular. Adım 2.2 takiben, hafifçe 4 ° C (bu hız, süre, ve aksi belirtilmedikçe bütün geri kalan adımları için sıcaklığında santrifüj) 0.5 xg / 1 dak tüm örneklerde 'boncuk santrifüj, buz üzerinde tüp yerleştirin, süpernatant kaldırmak ve LB + 10mM NEM 600 ul boncuklar tekrar askıya. Lizis tamponu + NEM 10mM yeniden askıya örnekleri 'boncuklar sonra, hemen buz üzerinde bu numune-HAM tüp içine 200 numunenin lizat-boncuk bulamaç ul ve deşarj toplamak. LB ilave bir 300 ul +-HAM örnek için 10 mM NEM eklendi, ve her bir numune içinde 500 ul toplam + HAM örnek için ilave bir 100 ul ekle. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin. Yeniden askıya (yıkama)-HAM ve + HAM örnekleri yavaşça 0.5 ml sıkı tampon, numune başına. Daha uzun bir SDS inkübasyon dan bağlı antikor çıkarılması neden olacağı için, hızlı bir şekilde bu adım gerçekleştirmeboncuk. Yavaşça LB pH 7,2 ve 0,5 ml / numune içindeki tüm numunelerin üç kez yıkayın, ve adım 3.2b gibi Yıkamalar arasında aşağı doğru döndürün. Adım 3.5 gerçekleştirirken, HAM tamponu (Tablo 1) hazırlayın. 0.5 ml LB pH 7.2, HAM + her numune hacmi içinde 1 M arasında bir nihai konsantrasyon elde etmek için, yeni bir boru ile hidroksilamin solüsyonu uygun miktarda ekleyin. Her deney günü taze HAM tamponu hazırlayın. Tüm-HAM örnekler ve tüm + HAM örnekleri HAM tamponu 0.5 ml / numune LB pH 7,2 ve 0,5 ml / numune ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 1 saat için tüm örnekler Nutate. 1 saat aşmayın. 4. Açil-Biotin Değişim: Biotin-BMCC Etiketleme Adım 3.6 gerçekleştirirken, LB pH 2 ml hazırlamak adım 3.1 'de olduğu gibi numune başına 6.2 (Tablo 1). Ihtiyaç kadar buz üzerinde LB pH 6.2 yerleştirin. Ayrıca kullanımdan hemen önce Biotin-BMCC (Tablo 1) bir stok solüsyon hazırlanır. Exac üzerinden tartılırBiotin-BMCC arasında tly 2.1 mg, 1.5 ml tüp içinde toplamak ve yavaşça 8mm konsantrasyon (tozu dağıtmak için bir pipet kullanmayan elde etmek için, oda sıcaklığında bir sallanan platform üzerine yerleştirilerek 0.5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülür ). Adım 3.6 tamamlandığında, yavaşça rezidüel HAM tampon kaldırmak için, pH 6.2 lizis tamponu kez boncuk yıkayın. Süpernatantı ve buz üzerinde örnekleri yer. Biotin-BMCC sistein serbest tiyol grupları (Şekil 1) için yüksek bir afiniteye sahiptir, bir maliemide biyotin konjuge bir moleküldür. Adım 4.2 gerçekleştirirken, 5 uM, 0,5 uM arasında çalışan konsantrasyonda, numune başına Biotin-BMCC Tamponu içinde 0.5 ml (Tablo 1) hazırlanması. 5 mcM aşan konsantrasyonlar olasılıkla hedef protein 6 doyurabilecek olacak ve genellikle aşılmamalıdır, ancak bu istenilen hedef protein bağlı olarak değişebilir. Her numune için Biotin-BMCC tamponu 0.5 ml ekleyin ve ve 4 de tam 1 saat nutatedeg; C. 1 saat aşmayın. 5. Biotin-konjuge Hedef Protein ve SDS-PAGE ve elüsyon Adım 4.3 tamamlandığında, yavaşça LB pH 6.2 'de bir kez tüm örnekler yıkayın. Yıkamalar arasında buz üzerinde tüm örnekler tutun. -20 ° C depolama hiçbir indirgeyici ajanlar (Tablo 1) ile 2x SDS Örnek Tamponu çıkarın ve yavaşça buz üzerinde eritin. Yavaşça LB pH 7.5 'te örnekleri üç kez yıkayın + PMSF / İnhibitörleri ve yıkar arasında buz örnekleri tutmak. Tüpün alt içinde kalan tampon ile bir bulamaç içinde peletlenmiş boncuklar bırakarak, üçüncü yıkama süpernatantı. Bulamaç ile tüpün çok dibine küçük çaplı ucu (bir jel yükleme ucu veya P2 pipet yeterlidir) ile bir pipet batırın ve hızlı bir şekilde herhangi boncuk almak için dikkatli olmak, kalan tampon toplamak. 5 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere DL-ditiyotretol (DTT) ile 2x SDS numune tamponu Supplement. EklemekHer numune için 2x Sample Buffer 40-50 ul + 5mM DTT. Gerekirse, vorteks boncuklar tamamen numune tamponu ile karıştırılması halinde, derhal numune tamponu batırılmış bir pelet tüm boncuk, toplamak için yüksek hızda santrifüj. 75-80, 10 dakika için tüm örnekler kaynatılır ° C. Tamamen pelet boncuk 16.000 az ≥ 10 tezgah üstüne dk ve santrifüj xg / 3 dk RT serin örnekleri edelim. Batı SDS-PAGE 7 kullanıyorsanız, kurutma için uygun bir poliakrilamid jel içinde tek şeride her örnekten Elüsyonlanan protein (süpernatant) tam hacmi ekleyin. Tek bir örnek için kontrol-HAM ve çıkarıcı solvent + HAM eluent SDS-PAGE (Şekil 2) boyunca birbirine hemen bitişik çalıştırılır ki bütün test edilen düzenleme. SDS-PAGE takiben, PVDF veya nitroselüloz membrana transfer. 6. Blotting ve Hedef Protein Palmitoylation Algılama Batı Adım 5.6 tamamlandığında, membran yıkamaİki kez RT de sallanan bir platform üzerinde 10 dakika süreyle Salin (TBS 1x) Tris tamponlu. TBS 1x bir hacim içinde% 3 ağırlık elde etmek için, (BSA), Bovine Serum Albumin üzerinden tartı ile spesifik olmayan etiketleme engellemek için bir engelleme tampon hazırlanması + tamamen batırmak zar için yeterli olan Tween-20% 0.05 (TBS-T) . Streptavidin kurutma için, her zaman BSA ile bloke değil, süt tozu. Bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat için zar engelleme. TBS-T +% 0.3 BSA bir antikor çözeltisi hazırlayın. Streptavidin-HRP antikor ekleme 1:5,000-1:10,000 seyreltilmiş distile su içinde 1 mg / ml 'de sulandırılır. Bir kez adım 6.2 tamamlandıktan sonra, 10 dakika için TBS-T içinde bir kere zar yıkayın, sonra 4 ° C de bir gece oda sıcaklığında 1 saat için ya da için bir sallanan platform üzerinde Streptavidin antikor çözeltisi içinde inkübe zar, ya da Bir sallanan platform üzerinde 10 dakika için TBS-T içinde zar üç kez yıkayın. Palmitoylation sinyali tespit etmek için, bir kimya kullanılarak HRP parlaklık sergilemekiluminescent substrat kiti. Immunoprecipitated olan ilgili proteini miktarı ile palmitoylation düzeylerini normal etmek için, oda sıcaklığında bir sallanan platform üzerinde 5-10 dakika için western blot sıyırma tamponu kullanılarak membran şeridi. 6.4 aslında immünopresipitasyon için kullanılan ilgili proteini karşı birincil antikor kullanarak – adımlar 6.1 tekrarlayın. Görüntü analiz programı kullanılarak ilgilenilen proteinin palmitoylation ölçmek ve immunoprecipitated protein miktarı palmitoylation seviyelerini normale.