Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

1. Extracção de proteína alvo a partir de neurónios do hipocampo em cultura primária Antes da colheita de proteína endógena de células primárias de hipocampo, preparar um tampão de lise (LB; Tabela 1), com inibidores de protease. A 10 ml de tampão de lise, adicionar 0,1 ml de solução de fluoreto de fenilmetano (PMSF) para uma concentração final de 10 mM, e adicionar uma protease comprimido cocktail inibidor. Preparar N-etilmaleimida (NEM) solução (Tabela 1) a partir de pó liofilizado. Gentilmente dissolver em EtOH a 100% à temperatura ambiente (RT). Sempre preparar solução NEM fresco para o dia do experimento. Em seguida combinam o tampão de lise e NEM. Adicionar 0,5 ml de solução 2M de NEM para um tubo cónico de 50 ml. Adicionam-se 20 ml de LB mais alto, e rapidamente LB lugar + NEM (concentração final de 50 mM) numa plataforma de agitação a 4 ° C para misturar completamente durante 5 min. Sempre adicionar NEM / EtOH segunda primeira solução e LB, de modo a adequadamente misturar os dois. Remover neurônios cultivados de incubadora e coloque em * gelo. Remova cuidadosamente mídia celulares, e lavar cuidadosamente duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de frio (PBS) 1x. Adicionar 300 ml de LB + 50 mM NEM ao primeiro poço de neurónios do hipocampo, e células scrape usando um levantador de células descartáveis. Recolher o lisado celular, em seguida, descarregar o lisado para o poço seguinte desse grupo. Raspe as células dentro do segundo poço usando o levantador célula, recolher, e repita usando um terceiro poço, se necessário, para concentrar ainda mais o lisado. Recolher o lisado celular em um pré-arrefecida (em gelo), o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita o passo 1.4, utilizando 100 ul de LB + NEM 50mm a recolher qualquer lisado celular restante. Passe lisado celular total através de uma seringa de calibre 26 ½ 5-6 vezes para ajudar a lise mecânica, tomando cuidado para não estourar bolhas na solução. Pode-se, em vez sonicate por 15 segundos no gelo, se o equipamento está disponível. Nutar lisado celular durante ≥ 30 min a 4 ° C. Esclarecer a Lysa celularte por centrifugação a 16.000 xg / 30 min, de modo a pelota não-lisadas células e insolúvel em detergente materiais. Colete limpou lisado celular (sobrenadante) em um novo tubo de ml pré-arrefecido em gelo 1,5. Repita protocolo colheita para todos os grupos de células. Concentração medida de proteína em todas as amostras de lisado usando BCA ensaio, e normalizar o volume de todas as amostras de lisados ​​a partir de grupos de células a ter exactamente iguais de proteína total, com um mínimo recomendado de 500 ug. Complete todas as amostras com LB + NEM 50mm a 500 ul de volume total. Adicionar 1-5 ug de anticorpo primário dirigida contra a proteína alvo para cada amostra de lisado. Nutar as amostras de anticorpos com lisado-misturados durante a noite a 4 ° C. * Neurónios primários do hipocampo do rato deverá ser cultivadas a uma densidade de cerca de 250.000 células / poço numa placa de 6 poços, em meio isento de soro, contendo um suplemento de B27 neuronal, como descrito anteriormente 5, e cultivadas durante a desejod período de tempo, tipicamente 14-16 dias in-vitro (DIV), para atingir a maturidade. Um mínimo de 500 ug de proteína total é recomendado para imunoprecipitar com sucesso e biotinylate uma proteína alvo neuronal, o que requer tipicamente 2-3 poços de uma placa de 6 poços. 2. Precipitação de anticorpo ligada Proteína Alvo Antes de precipitação e de imobilização de uma proteína-alvo, preparar uma suspensão de 50% de proteína A ou proteína G-esferas revestidas de sefarose. Especificamente, adiciona ≥ ul 60 de esferas de sefarose por amostra para tubos de 1,5 ml, assegurando que todas as amostras têm a mesma quantidade de grânulos. Esferas magnéticas são também adequados se o equipamento disponível. Adicionar um volume igual de suspensão de 50% para cada uma das amostras de anticorpo ligado, e para nutar ≥ 1 hora a 4 ° C. 3. Acil-Biotina Exchange: Hidroxilamina clivagem (HAM) Embora a execução da etapa 2.2, preparar uma série de tubos com tampão de lise (LB) de dipHs fferent. O pH é muito importante para estes passos e deve ser sempre ajustada usando um medidor de pH. Preparar 2 ml de LB pH 7,2 por amostra, e 0,5 ml de Tampão rigorosa por amostra (Tabela 1). Também preparar 0,5 ml LB + 10 mM NEM, por exemplo, tal como nos passos 1,1-1,3. Adicionar PMSF e comprimidos inibidores de protease para todas as soluções tampão de lise, tal como no passo 1.1. Hidroxilamina (HAM) é um potente agente redutor, cuja clivagem de palmitato de cisteínas é necessária para a biotinilação (Figura 1), e a omissão da clivagem HAM serve como um controlo negativo. Dividir cada amostra de grânulos em duas amostras, uma omitindo o passo de clivagem HAM (HAM-), e um que inclui o passo de HAM (+ HAM). Para normalizar para a degradação de proteínas provocada por tratamento HAM, deve-se dividir cada uma das amostras em terços, com 1/3 das pérolas utilizadas para o controlo da HAM-, e os restantes 2/3 utilizado para o tratamento de HAM +. Preparar um adicional.5 ml tubos em gelo, rotulados como a HAM-controlo para cada amostra. Seguindo a etapa 2.2, centrifugar suavemente grânulos todas amostras de 0,5 xg / 1 min a 4 ° C (centrifugadora a esta velocidade, duração e temperatura para todas as etapas restantes, a menos indicação em contrário), coloque os tubos em gelo, remover o sobrenadante, e re-suspender as pérolas em 600 ul de 10 mM de LB + NEM. Após re-suspensão das amostras pérolas em tampão de lise + NEM 10 mM, recolher imediatamente 200 pi de suspensão da amostra de lisado de-conta, e a descarga para que a amostra do tubo de HAM-se em gelo. Adicionar um adicional de 300 jil de LB + 10 mM de NEM a amostra a HAM-, e um adicional de 100 ul de amostra de HAM + para um total de 500 ul de cada amostra. Incubar os tubos durante 10 min em gelo. Re-suspender (lavar) o HAM-HAM e amostras + delicadamente com 0,5 ml de tampão rigorosos, por amostra. Executar este passo de forma rápida, como mais tempo de incubação de SDS irá resultar na remoção do anticorpo ligado a partir dagrânulos. Lavar cuidadosamente todas as amostras três vezes em 0,5 ml / amostra de pH 7,2 LB, e girar entre lavagens como em 3.2b passo. Embora a execução da etapa 3.5, preparar um tampão HAM (Tabela 1). Adicionar o volume apropriado de solução de hidroxilamina para um novo tubo, para atingir uma concentração final de 1 M em um volume de 0,5 ml de pH LB 7,2, por exemplo + HAM. Sempre preparar o tampão de HAM fresco para o dia do experimento. Adicionar 0,5 ml / amostra de pH 7,2 a todos os LB-HAM amostras, e 0,5 ml / amostra de tampão de HAM a todos os exemplos de HAM +. Nutar todas as amostras durante 1 h à temperatura ambiente (RT). Não exceder 1 hora. 4. Acil-Biotina Exchange: Biotina-BMCC Etiquetagem Embora a execução da etapa 3.6, preparar 2 ml de LB pH 6,2 por amostra (Tabela 1), como descrito no passo 3.1. Coloque a pH 6,2 LB em gelo até ser necessária. Também preparar uma solução stock de Biotina-BMCC (Tabela 1), imediatamente antes de usar. Pesar exacerbartly 2,1 mg de biotina-BMCC, recolhe em um tubo de 1,5 ml, e gentilmente dissolver em 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO), colocando numa plataforma oscilante à temperatura ambiente, para atingir a concentração 8mM (não utilizar uma pipeta para dispersar o pó ). Uma vez passo 3.6 é completado, lavar cuidadosamente as pérolas uma vez em tampão de lise de pH 6,2, para remover o tampão residual HAM. Remover o sobrenadante e colocar as amostras em gelo. Biotina-BMCC é uma molécula de biotina maliemide conjugado que possui uma elevada afinidade para grupos tiol livres de cisteinas (Figura 1). Embora a execução da etapa 4.2, preparar 0,5 ml de biotina-BMCC Buffer (Quadro 1) por exemplo, a concentração de trabalho entre 0,5 pM a 5 pM. As concentrações superiores a 5 uM serão provavelmente saturar a proteína alvo 6, e normalmente não devem ser excedidos, no entanto esta pode variar, dependendo da proteína alvo desejado. Adicionar 0,5 ml de biotina-BMCC tampão para cada amostra, e para nutar exactamente 1 hora a 4 ° C. Não exceder 1 hora. 5. A eluição de biotina-conjugado proteína-alvo e SDS-PAGE Uma vez que passo 4.3 for concluída, lavar cuidadosamente todas as amostras de vez em pH 6,2 LB. Mantenha todas as amostras em gelo, entre lavagens. Remover 2x Tampão de amostra de SDS sem agentes redutores (tabela 1) de armazenamento de -20 ° C e, lentamente, descongelar em gelo. Lavar suavemente as amostras três vezes em LB pH 7,5 + PMSF / Inhibitors, e manter as amostras em gelo, entre lavagens. Remover o sobrenadante do terceira lavagem, deixando as pérolas peletizadas em uma pasta fluida com um tampão que permanece no fundo do tubo. Mergulhe uma pipeta com uma ponta de pequeno diâmetro (a ponta de carga gel ou ponta P2 pipeta são suficientes) para o fundo do tubo através da lama, e recolher rapidamente qualquer solução restante, com cuidado para não tomar quaisquer contas. Suplementar o Tampão de amostra de SDS 2x com DL-ditiotreitol (DTT) para atingir uma concentração final de 5 mM. Adicionar40-50 ul de tampão de amostra 2x + DTT 5 mM a cada amostra. Se necessário, os grânulos de vórtice para misturar completamente com o tampão de amostra e centrifugar imediatamente em alta velocidade para recolher todos os grânulos em um pellet, submerso, em tampão de amostra. Ferver as amostras durante 10 min a 75-80 ° C. Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente durante 10 min ≥ em cima da bancada, e centrifuga-se a 16.000 xg / 3 min para sedimentar as pérolas completamente. Adicionar o volume total de proteína eluída (sobrenadante) a partir de cada amostra para dentro de uma única pista de um gel de poliacrilamida adequado para transferência de western, utilizando SDS-PAGE 7. Organizar todas as amostras de modo a que a HAM-eluente e controlo eluente HAM + para uma única amostra são executados imediatamente adjacentes um ao outro durante a SDS-PAGE (Fig. 2). Na sequência de SDS-PAGE, transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF. 6. Western Blotting e Detecção de palmitoilação da Proteína Alvo Uma vez que 5,6 etapa é concluída, lava-se a membranaduas vezes em solução salina tamponada com Tris (TBS 1x) durante 10 min numa plataforma de agitação à temperatura ambiente. Preparar um tampão de bloqueio para bloquear o não-específica pela rotulagem pesando Albumina de Soro Bovino (BSA), para atingir o peso de 3% em volume de TBS 1x + Tween-20 a 0,05% (TBS-T), que é suficiente para submergir completamente a membrana . Para estreptavidina blotting, sempre bloquear com BSA e não leite em pó. Bloquear a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. Prepara-se uma solução de anticorpo de TBS-T + BSA a 0,3%. Adicionar Estreptavidina-HRP anticorpo reconstituído em 1 mg / ml em água destilada, diluiu-se a 1:5,000-1:10,000. Uma vez passo 6.2 é completado, lava-se a membrana uma vez em TBS-T, durante 10 min, depois incubar a membrana em solução de estreptavidina anticorpo numa plataforma oscilante durante ou durante 1 hora à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. Lava-se a membrana três vezes em TBS-T, durante 10 minutos numa plataforma oscilante. A fim de detectar o sinal de palmitoilação, expor a luminescência HRP utilizando um chemkit de substrato iluminescent. A fim de normalizar os níveis de palmitoilação para a quantidade de proteína de interesse que foi imunoprecipitado, descascar a membrana com tampão de transferência de Western de extracção durante 5-10 min numa plataforma de agitação à temperatura ambiente. Repita os passos 6,1-6,4 utilizando o anticorpo primário contra a proteína de interesse que foi originalmente usado para a imunoprecipi tacão. Palmitoilação de quantificar a proteína de interesse utilizando o software de análise de imagem, e normalizar os níveis de palmitoilação para a quantidade de proteína imunoprecipitada.