Summary

Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Published: November 21, 2012
doi:

Summary

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Abstract

Periferik sinirlerin gelişimi ilginç bir süreçtir. Nöronlar insanlarda 100'den fazla cm uzaklıkta nöronun soma gelen genellikle belirli hedeflere, innerve aksonlar gönderir. Gelişme sırasında nöronal hayatta kalma hedef türevi büyüme faktörleri üzerinde değil, aynı zamanda Schwann hücreleri (SC'ler) bir desteğe bağlıdır. Sinaps veya nöromuskuler kavşağa nöronal soma (veya merkezi periferik sinir sistemine geçiş) bölgesinden Bu amaçla SC ensheath aksonlar için. Schwann hücreleri nöral krest türevleri ve tüm akson SC'ler ile kaplıdır kadar çıkan aksonlar boyunca habercileri olarak göç ederler. Bu periferik sinir sisteminin gelişimi için SC göçün önemini göstermektedir ve bu sürecin araştırılması gerekliliğini vurgulamaktadır. SC gelişme analiz etmek için, bir ayar da geçiş için onların fizyolojik alt tabaka, akson içeren SCs yanında olan ihtiyaç vardır. Intrauterin gelişme nedeniyle <em> in vivo time-lapse görüntüleme, ancak, (Mus musculus) fare gibi plasental omurgalılarda mümkün değildir. Bunu aşmak için, biz üstün servikal ganglion (SCG) eksplant tekniği uyarlanmıştır. Sinir büyüme faktörü (NGF) ile tedavi üzerine SCG eksplantlar gangliyondan çevreye aksonları boyunca göç SC öncüleri takip aksonlar uzatmak. Bu sistemin güzelliği SC endojen SC bir havuz ve onlar aynı anda büyüyor kendi fizyolojik aksonlar boyunca göç ettiğini elde olmasıdır. Aksonlar boyunca SC gelişimi SC göç içgörüler kazanmak için başka imkanların açıldığı, time-lapse görüntüleme ile analiz edilebilir, çünkü bu sistem, özellikle şaşırtıcıdır.

Protocol

1. Kollajen Jeller hazırlanması 455 ul 10x MEM, 112 ul% 7.5 NaHCO3, 50 ul glutamin ve NaOH içeren bir stok ortamı hazırlayın. Konsantrasyon ve NaOH miktarı sıçan kuyruğu kolajeni hazırlanması (1.2), 1.000 ul olmak stok orta son hacmine bağlıdır. Ebendal (1) 'e göre-fare kuyruk kolajeni hazırlayın. 4 ° C'de depolayın Kolajen çözeltisi Kollajen çözümün bir bozulma gözlenmemektedir. Yeni bir toplu hazırlandıktan sonra, (1.1) stok ortam i?…

Representative Results

Aksonal büyüme NGF (4) (film düzeni S1 Şekil 1 düzeni) ile muamele üzerine ikinci eksplantlar SCG kolaylaştırılır. Bu işlem herhangi bir inverted mikroskop ile görülebilen ve time-lapse görüntüleme (film S2) takip edilebilir. Bir bilim adamı fare embriyoları SCG diseksiyon için yeni ise şiddetle basit bir anti-tirozin hidroksilaz (TH) immünohistokimyasal olarak tekniğin bir doğrulama öneririz. TH etiketi aksonlar (Şekil 2B) katekolaminerjik nör…

Discussion

Periferik sinir sisteminin gelişimi heyecan verici bir süreçtir. Gelişimi tamamlandıktan sonra, aksonların, insanlarda, sık sık, 100 cm olabilir tüm uzunluğu boyunca, SKS ile ensheathed edilir. Bu amaca yönelik olarak, gerekli SCs sayısı doğru gelişme sırasında oluşturulmalıdır ve SCs da tam kapsamı sağlamak aksonal için çevre uzanan akson boyunca hareket etmek zorunda. Bu miyelinli hem de için unmeylinated aksonlar için de geçerlidir. Her iki durumda da tüm aksonların SCs ile temas halinde …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz mükemmel teknik destek için bir kollajen protokol ve Jutta Fey ve Ursula Hinz paylaşmak için Urmas Arumae teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca biz nazik Video Atış için yardım için Hıristiyan F. Ackermann, Ulrike Engel ve Heidelberg Üniversitesi Nikon Görüntüleme Merkezi ve ayrıca Joachim Kirsch teşekkür etmek istiyorum. Çalışma kısmen Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592) yoluyla finanse edildi.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
10x MEM Gibco 21430
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080
Glutamine Gibco 25030
NaOH Merck 109137
NGF Roche 1058231 R&D#556-NG-100
Neurobasal Medium Gibco 21103
B27 Supplement Gibco 17504
antibiotics Gibco 15640
d-PBS Gibco 14040
insect needles FST 26002-20
syringe needle Braun BD # 300013
8 well chamber slide Lab tek 177402

References

  1. Ebendal, T., Rush, R. A. . Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. IBRO Handh, (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6 (12), e28692 (2011).
  3. Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).
  4. Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).
  5. Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34 (1), 39-51 (2001).
  6. Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).
  7. Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).
  8. Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
  9. Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).
  10. Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).
  11. Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  12. Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).
  13. Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).

Play Video

Cite This Article
Heermann, S., Krieglstein, K. Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons. J. Vis. Exp. (69), e50016, doi:10.3791/50016 (2012).

View Video