Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי
Summary
אנו מתארים assay אבחון יקר שעלולים לשמש כדי להחליט הנסיגה של דיכוי חיסוני לאחר השתלה ללא סיכון מוגבר לדחיית שתל. Assay משתמש בעקרונות של רגישות יתר מושהה סוג ומספק הערכה מדויקת של שתי התגובות רכובים על ידי מקבלי חיסון מפעיל ורגולציה הספציפיות תורמות.
Abstract
תגובת רגישות יתר מושהה מסוג (DTH) היא מהירה בביטוי vivo של תגובה החיסונית של תאים תלויות T לאנטיגן זר (Ag) שהמערכת החיסונית של המארח שחוותה בתקופה האחרונה. תגובות DTH לעתים קרובות נחלקות לשלב רגישות, בהתייחסו לניסיון הראשוני אנטיגן, ושלב אתגר, אשר בדרך כלל עוקב אחר כמה ימים לאחר רגישות. חוסר תגובת רגישות יתר מאוחר מסוג להוכיח על ידי בדיקת עור Ag זוכרים נתפש לעתים קרובות כעדות לanergy. Assay DTH המסורתי נעשה שימוש יעיל באבחון זיהומי חיידקים רבים.
למרות שיתוף תכונות דומות חיסוניות כגון חדירה לימפוציטים, בצקת, ונימקו ברקמות, DTH הישיר אינו טכניקת אבחון אפשרית בחולים שעבר השתלה בשל האפשרות של הזרקה הישירה וכתוצאה מכך הרגישות לאנטיגנים תורמים ואובדן שתל. כדי להימנע מבעיה זו, הזמזוםלעכבר "טרנס vivo" assay DTH פותח 1,2. מבחן זה הוא במהותו assay DTH העברה, שבו תאי דם היקפי אדם mononuclear (PBMCs) ואנטיגנים ספציפיים הוזרקו מתחת לעור לתוך הנוצות או שודדים דרכים של עכבר נאיבי ונפיחות דמוית DTH נמדדים לאחר 18-24 שעות 3. מצגת אנטיגן על ידי תאי מציגי אנטיגן אנושיים כמו מקרופאגים או DCs לתאי T ברקמת כלי דם עכבר מאוד מעוררת את המפל הדלקתי ומושכת אליו תאים של מערכת חיסון וכתוצאה מעכבר תגובות נפיחות. התגובה היא אנטיגן ספציפי ודורשת רגישות אנטיגן מוקדמת. תגובת DTH תורם תגובה חיובית בטלביזית assay-DTH משקפת כי מטופל ההשתלה פיתחה נטייה הפרו דלקתית חיסונית כלפי alloantigens שתל.
התכונה החשובה ביותר של assay זה היא שזה גם יכול לשמש כדי לזהות תאי T רגולטוריים, הגורמים לדיכוי עובר אורח. דיכוי של עובר אורחהתגובה זוכרת DTH בנוכחות של אנטיגן התורם היא אופיינית למושתלים עם allografts המקובל 2,4-14. הניטור של מושתלים לalloreactivity ורגולציה על ידי TV-DTH עשוי לזהות תת קבוצה של חולים שיכולים ליהנות מן ההפחתה של דיכוי חיסוני בלי סיכון גבוה של דחייה או תפקוד כליות הולכים ומתדרדר.
אזור מבטיח הוא היישום של assay TV-DTH בניטור של אוטואימוניות 15,16 וגם באימונולוגיה גידול 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay DTH טרנס vivo הוא בדיקת אבחון רומן עם יישום קליני פוטנציאלי בהערכת תגובות מתווכות תאים בהשתלה, חולי סרטן ואוטואימוניות. זה הוא בעל ערך משום שהוא שימושי לא רק בניטור תגובות מפעיל לא זוכר, אבל גם זה יכול לזהות תגובות T רגולטוריים. דרך אמינה לגילוי הרגולציה DTH אדם עשויה לנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר בתרומתו של עם VanBuskirk לפיתוח ההבנה של תגובת DTH המוסדרת במושתלים שלנו. עבודה זו נתמכה NIH מענקי PO1AI084853 וR01AI066219-06, ועל ידי מחקר אחד בחסות איחוד אירופי.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs& Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the ‘tolerance assay’: In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the ‘tolerance assay’. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Cai, J., et al. Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
