في الصعق الكهربائي من البيضة ميرنا القائم على البلازميدات في أنبوب للتطوير والعصبية تقييم نمط ظاهري من حقن مبادرة ديزرتك الصناعية في الكتاب المفتوح الاستعدادات
Summary
ووصف الطريقة التي التعبير الجيني في الأنبوب العصبي يمكن أن يكون downregulated بطريقة الخلية، اكتب محددة يمكن عزوها. نحن لشرح كيفية<em> في البيضة</emويمكن استخدام> الصعق الكهربائي من الرنا الميكروي القائم على البلازميدات التي تثير تسيطر spatiotemporally RNA تدخل للتحقيق في صواري التوجيه محور عصبي في أنبوب للالعصبية النامية.
Abstract
تم صواري dI1 الخلايا العصبية درس على نطاق واسع لتوضيح الآليات الكامنة والتوجيه محور عصبي خلال 1،2 التنمية. وتقع هذه الخلايا العصبية في النخاع الشوكي الظهري وإرسال محاور عصبية على طول مسارات النمطية. محاور عصبية صواري المشروع في البداية ثم بطنيا نحو عبر floorplate. بعد عبور خط الوسط، وهذه المحاور جعل منعطفا حادا منقاري والمشروع طوليا نحو الدماغ. وينظم كل من هذه الخطوات من قبل العظة من الأنشطة المنسقة جذابة ومثيرة للاشمئزاز التوجيه. التفسير الصحيح لهذه العظة هو أمر حاسم في توجيه محاور عصبية على طول الطريق من ترسيمها. وهكذا، يتم التحقيق بشكل مثالي مساهمة الفسيولوجية للجزيء خاص لتوجيه محور عصبي صواري في سياق الجنين المعيشة. وفقا لذلك، لا بد من ضربة قاضية الجينات في الجسم الحي تسيطر على وجه التحديد من أجل التمييز بعناية أنشطة التوجيه محور عصبي من الجينات التي قد تلعب متعددةالأدوار خلال التنمية.
هنا، نحن تصف طريقة لضربة قاضية التعبير الجيني في الأنبوب العصبي الدجاج بطريقة الخلية، اكتب محددة يمكن عزوها. نستخدم ناقلات بلازميد رواية 3 بإيواء الخلايا من نوع محدد المروجين / القدرة التي تدفع التعبير عن بروتين فلوري علامة، يتبعها مباشرة نسخة miR30-رني 4 (تقع داخل UTR-3'من [كدنا] ترميز البروتين الفلورسنت) ( الشكل 1). عندما electroporated في أنبوب للالعصبية النامية، هذه النواقل حصول downregulation كفاءة في التعبير الجيني والتعبير عن البروتينات علامة مشرقة الفلورسنت لتمكين تتبع مباشرة من الخلايا التي تعاني من ضربة قاضية 3. خلط مختلفة ناقلات رني قبل الصعق الكهربائي في وقت واحد يسمح للضربة قاضية من اثنين أو أكثر من الجينات في المناطق المستقلة من الحبل الشوكي. هذه التفاعلات المعقدة يسمح الخلوية والجزيئية للفحص خلال التنمية، على نحو سريع، قimple ودقيقة وغير مكلفة. بالاشتراك مع مبادرة ديزرتك الصناعية تتبع مسارات محور عصبي صواري في كتاب مفتوح التحضيرات 5، هذا الأسلوب هو أداة مفيدة لفي الدراسات المجراة من الآليات الخلوية والجزيئية للنمو محور عصبي صواري والتوجيه. من حيث المبدأ، يمكن أن تستخدم أي مروج / محسن، مما يجعل هذه التقنية يحتمل أكثر قابلية للتطبيق على نطاق واسع لفي الدراسات المجراة من خلال وظيفة الجين التنمية 6.
هذا الفيديو يوضح أولا كيف للتعامل مع نافذة والبيض، وحقن البلازميدات الحمض النووي في الأنبوب العصبي وإجراءات الصعق الكهربائي. للتحقيق في صواري التوجيه محور عصبي، تتم إزالة الحبل الشوكي من الجنين باعتباره إعداد كتاب مفتوح، ثابتة، وحقنوا مبادرة ديزرتك الصناعية للتمكين من تتبع مسارات محور عصبي. هي التي شنت الحبل الشوكي بين coverslips وتصور باستخدام المجهر متحد البؤر.
Protocol
Discussion
ويمكن استخدام هذه بسيطة، المستندة إلى متجه التعبير ميرنا الاصطناعي استراتيجية في التعبير الجيني الذاتية ضربة قاضية في الأنبوب العصبي الدجاج. هذه الأدوات وظيفية متعددة تقدم إسكات الجينات والتحكم الزمني وخصوصية من نوع الخلية، لتيسير الكشف عن مسارات تنموية معقدة. عل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم عمل في مختبر ES من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية. نود أن نشكر الدكتور فوز كونز للحصول على المساعدة مع التصوير.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| 0.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B120F-4 |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 |
| Electroporator | BTX | ECM 830 |
| Sylgard silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 |
| Tungsten wire, 0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 |
| Insect pins, 0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
| Insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 |
| Fluorescent microscopes | Olympus | SZX12, BX51 |
References
- Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
- Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Development. 4, 21 (2009).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development. Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).
- Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).
- Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo. Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29, 123-132 (2001).
- Kieleczawa, J. Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats. Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo. J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).
- Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices. Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).
- Murphy, M. C., Fox, E. A. Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract. Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Li, X., Lufkin, T. Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III. Genesis. 26, 121-122 (2000).
- Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).
- Cullen, B. R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments. Nature Methods. 3, 677-681 (2006).
