In elettroporazione ovo di miRNA-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da Injection DiI in Open-book Preparazioni

Commissurali DI1 neuroni sono stati ampiamente studiati per chiarire i meccanismi alla base di orientamento degli assoni durante ^1,2 sviluppo. Questi neuroni sono situati nel midollo spinale dorsale e inviare loro assoni lungo traiettorie stereotipati. Assoni commissurali inizialmente proiettare ventralmente verso e poi in tutto il fondello. Dopo aver attraversato la linea mediana, questi assoni compiere una brusca virata rostrale e progetto longitudinalmente verso il cervello. Ciascuna di queste fasi è regolata dalle attività coordinate di spunti di orientamento attrattive e repulsive. La corretta interpretazione di questi segnali è fondamentale per la guida degli assoni lungo il loro percorso delimitata. Pertanto, il contributo fisiologica di una particolare molecola di guida assonale commissurali è idealmente esaminati nel contesto dell'embrione vivente. Pertanto, knockdown gene in vivo devono essere controllati con precisione per distinguere attentamente attività di orientamento assone di geni che possono svolgere moltepliciruoli durante lo sviluppo.

Qui, si descrive un metodo per l'espressione del gene knockdown nel tubo neurale pollo in una cella di tipo-specifico, modo tracciabile. Usiamo nuovi vettori plasmidici ³ harboring cellule tipo-specifici promotori / enhancer che guidano l'espressione di una proteina marker fluorescente, seguito direttamente dal miR30-RNAi trascrizione ⁴ (situato all'interno del 3'-UTR del cDNA che codifica la proteina fluorescente) ( la figura 1). Quando elettroporati nel tubo neurale in via di sviluppo, questi vettori suscitare sottoregolazione efficace di espressione genica e di esprimere proteine ​​marker luminosi fluorescenti per attivare l'analisi diretta delle cellule vivendo knockdown ^3. Mescolando diversi vettori RNAi prima elettroporazione permette knockdown simultanea di due o più geni indipendenti in regioni del midollo spinale. Questo consente complesse interazioni cellulari e molecolari da esaminare durante lo sviluppo, in un modo che è veloce, sattua, preciso ed economico. In combinazione con DiI tracciamento delle traiettorie assoni commissurali in open-book preparati ^5, questo metodo è un utile strumento per studi in vivo dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni commissurali e di orientamento. In linea di principio, qualsiasi promotore / enhancer potrebbe essere utilizzato, rendendo potenzialmente la tecnica più ampiamente applicabile per studi in vivo della funzione del gene durante lo sviluppo ^6.

Questo video mostra prima come gestire e uova finestra, l'iniezione di plasmidi di DNA nel tubo neurale e la procedura di elettroporazione. Per studiare la guida commissurali dell'assone, il midollo spinale viene rimosso dall'embrione come un libro aperto di preparazione, fissato, e iniettato con DiI per consentire percorsi assoni da tracciare. Il midollo spinale è montata tra coprioggetto e visualizzati usando la microscopia confocale.