In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen

Commissurale DI1 neuronen zijn uitgebreid bestudeerd om de mechanismen axon begeleiding bij ontwikkeling ^1,2 helderen. Deze neuronen in de dorsale ruggenmerg en sturen hun axonen langs stereotype trajecten. Commissurale axonen in eerste instantie ventraal projecteren richting en dan over de vloerplaat. Na het oversteken van de middellijn, deze axonen maken een scherpe bocht rostrale en project lengterichting naar de hersenen. Elk van deze stappen wordt geregeld door de gecoördineerde activiteiten van aantrekkende en afstotende begeleiding cues. De juiste interpretatie van deze signalen is cruciaal voor de begeleiding van axonen langs hun afgebakende pad. Aldus wordt de fysiologische bijdrage van een bepaalde molecule te commissurale axon begeleiding voorkeur onderzocht in de context van de levende embryo. Bijgevolg moet gen knockdown in vivo nauwkeurig worden gecontroleerd om zorgvuldig onderscheid te maken axon begeleiding activiteiten van genen die kunnen spelen meerdererollen tijdens de ontwikkeling.

Hier beschrijven we een methode om knockdown genexpressie in de kip neurale buis op een celtype-specifieke, traceerbare wijze. We gebruiken novel plasmidevectoren ³ herbergen celtype-specifieke promoters / enhancers die de expressie van een fluorescerend eiwit marker rijden, direct gevolgd door een miR30-RNAi transcript ⁴ (binnen de 3'-UTR van het cDNA dat codeert voor het fluorescent protein) ( figuur 1). Wanneer geëlektroporeerd in het ontwikkelende neurale buis, deze vectoren efficiënt opwekken downregulatie van genexpressie en expressie helder fluorescente merker eiwitten kunnen direct traceren van de cellen ervaren knockdown ^3. Het mengen van verschillende RNAi vectoren voor elektroporatie kan gelijktijdig knockdown van twee of meer genen in onafhankelijke delen van het ruggenmerg. Dit maakt complexe cellulaire en moleculaire interacties worden onderzocht tijdens de ontwikkeling, op een manier die snel, suitvoering, nauwkeurig en goedkoop. In combinatie met Dil tracing van commissurale axon trajecten in open-boek voorbereidingen ^5, deze methode is een handig hulpmiddel voor in vivo studies van de cellulaire en moleculaire mechanismen van commissurale axongroei en begeleiding. In principe kan elke promoter / enhancer worden gebruikt, mogelijk waardoor de techniek breder toepasbaar voor in vivo studies van genfunctie tijdens de ontwikkeling ^6.

Deze video toont eerst hoe naar en venster eieren, de injectie van DNA plasmiden in de neurale buis en de elektroporatie procedure. Om commissurale axon begeleiding te onderzoeken, wordt het ruggenmerg verwijderd van het embryo als een open boek voorbereiding, vast, en geïnjecteerd met Dil zodat axon paden te traceren. Het ruggenmerg wordt tussen dekglaasjes en gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie.