גידול והזרקה של<em> Manduca סקסטה</em> זחלים להערכה ארסית קטריאלי
Summary
השיטה המתוארת כאן מנצלת הזרקה ישירה של חיידקי entomopathogenic לhemocoel של<em> Manduca סקסטה</em> זחלי חרקים.<em> מ סקסטה</em> הוא חרק זמין מסחרי ונחקר היטב. לכן, שיטה זו מייצגת גישה פשוטה לניתוח אינטראקציות מארח בקטריאלי מנקודת המבט של אחד או שני בני הזוג.
Abstract
Manduca סקסטה, הידוע בכינויו hornworm הטבק, נחשבת למזיק חקלאי משמעותי, האכלה על צמחי solanaceous כוללים טבק ועגבנייה. רגישותו של מ ' זחלי סקסטה למגוון מיני entomopathogenic חיידקי 1-5, כמו גם השפע של מידע הזמין לגבי מערכת חיסון של חרק 6-8, ואת רצף הגנום עד 9 להפוך אותו לאורגניזם מודל טוב לשימוש בחקר אינטראקציות מארח חיידק במהלך פתוגנזה. בנוסף, מ ' זחלי סקסטה גדולים יחסית וקלים לתפעל ולתחזק במעבדה היחסית למיני חרקים רגישים אחרים. ממדיהן גדולים גם מאפשרים מיצוי רקמה / hemolymph יעיל לניתוח של תגובת המארח לזיהום.
השיטה שהוצגה כאן מתארת הזרקה הישירה של חיידקים לhemocoel (חלל דם) של מ ' זחלי סקסטה. גישה זוניתן להשתמש בו כדי לנתח ולהשוות את המאפיינים הארסיים של מינים שונים של חיידקים, נקע, או פשוט על ידי מוטציות ניטור הזמן למות חרק לאחר הזרקה. שיטה זו פותחה ללמוד פתוגניות של Xenorhabdus ומיני Photorhabdus, אשר בדרך כלל לקשר עם וקטורים נמטודות כאמצעי לזכות כניסה לחרקים. נמטודות Entomopathogenic בדרך כלל להדביק זחלים דרך עיכול טבעי או פתחי נשימה, ולשחרר את תוכנם לתוך החיידקים סימביוטיים hemolymph החרקים (דם) זמן קצר לאחר מכן 10. שיטת ההזרקה המתוארת כאן עוקפת את הצורך בוקטור נמטודות, ובכך מתירה את ההשפעות של חיידקים ונמטודות על החרקים. שיטה זו מאפשרת לספירה מדויקת של חומר מדבק (תאים או חלבונים) בבידוד, דבר שאינו אפשרי בשיטות קיימות אחרות לניתוח entomopathogenesis, כוללות לסחוב 11 ומבחני רעילות אוראליים 12 <eמ '>. כמו כן, מבחני רעילות אוראליים לטפל הארסיות של רעלים מופרשים הציגו לתוך מערכת העיכול של זחלים, ואילו בשיטת ההזרקה הישירה כתובות הארסיות של inocula כל התאים.
התועלת של שיטת ההזרקה הישירה כפי שתואר כאן היא לנתח פתוגנזה חיידקים על ידי ניטור תמותת חרקים. עם זאת, שיטה זו יכולה בקלות להיות מורחבת לשימוש בחקר ההשפעות של זיהום על מ ' מערכת חיסונית של סקסטה. החרקים מגיבים לזיהום באמצעות שתי תגובות הומורלית ותאיות. התגובה הומורלית כוללת זיהוי תבניות חיידקים הקשורים והפקה הבאה של פפטידים שונים מיקרוביאלית 7; הביטוי של גני מקודדי חלבונים אלה יכול להיות במעקב לאחר זיהום ישיר באמצעות RNA חילוץ וכמותית PCR 13. התגובה התאית לזיהום כרוך nodulation, אנקפסולציה, וphagocytosis של חומרים מזהמים על ידי hemocytes 6 </sup>. כדי לנתח את התגובות האלה, חרקים מוזרקים יכולים להיות גזורים ומדמיינים ידי מיקרוסקופיה 13, 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההזרקה הישירה של מ ' זחלי סקסטה עם חיידקי entomopathogenic, כפי שמתוארים כאן, משמשים כאמצעי פשוט ויעיל לניתוח ארסיות חיידקים. השיטה היא גם ישימה מאוד כדי להתאים לנושאים ניסיוניים שונים ו / או תנאים. חיידקים יכולים להיות מוכנים בדרכים קודמות להזרקה שונות. במקרה של <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של גודריץ-בלייר המעבדה: סמנתה אורצ'רד, קימברלי קאולס, ארין הרברט-טראן, גרג ריצ'רדס, מייגן נרד, וYoungjin פרק על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק קרן המדע הלאומי IOS-0950873 והמכונים הלאומיים לבריאות NRSA המלגה FAI084441Z.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D’Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
