Opfok en Injectie van<em> Manduca sexta</em> Larven naar bacteriële virulentie beoordelen
Summary
De hier beschreven methode maakt gebruik van directe injectie van entomopathogene bacteriën in de hemocoel van<em> Manduca sexta</em> Insectenlarven.<em> M. Sexta</em> Is een commercieel verkrijgbaar en goed bestudeerde insect. Aldus is deze methode een eenvoudige benadering voor het analyseren gastheer-bacteriële interacties vanuit een of beide partners.
Abstract
Manduca sexta, algemeen bekend als de tabak hornworm, wordt beschouwd als een belangrijke en tuinbouw en daarbuiten, het voeden op Solanaceae planten, met inbegrip van tabak en tomaat. De gevoeligheid van M. sexta larven van verschillende bacteriesoorten entomopathogene 1-5, evenals de rijkdom aan informatie beschikbaar over het insect immuunsysteem van 6-8 en de hangende genoomsequentie 9 het een goede modelorganisme voor gebruik bij het bestuderen gastheer-microbe interacties tijdens pathogenese. Bovendien M. sexta larven zijn relatief groot en gemakkelijk te manipuleren en te behouden in het laboratorium opzichte van andere gevoelige insectensoorten. Hun grote formaat maakt het ook efficiënt weefsel / hemolymfe extractie voor de analyse van de gastheer respons op infectie.
Werkwijze hier gepresenteerde beschrijft de directe injectie van bacteriën in de hemocoel (bloedholte) van M. Sexta larven. Deze benaderingkunnen worden geanalyseerd en de virulentie kenmerken van verschillende bacteriesoorten, stammen, of mutanten vergelijken eenvoudig bewaken van de tijd insect dood na injectie. Deze methode is ontwikkeld om de pathogeniteit van Xenorhabdus en Photorhabdus species die typisch associëren met nematode vectoren als middel om toegang tot het insect krijgen bestuderen. Entomopathogene nematoden meestal besmetten larven via natuurlijke spijsvertering of respiratoire openingen, en laat hun symbiotische bacteriën inhoud in het insect hemolymfe (bloed) kort daarna 10. De injectiemethode hier beschreven omzeilt de noodzaak van een nematode vector, waardoor het loskoppelen van de effecten van bacteriën en nematode op het insect. Deze methode zorgt voor nauwkeurige kwantificering van besmet materiaal (cellen of eiwit) in de inoculum, wat niet mogelijk is met andere bestaande methodes voor het analyseren entomopathogenesis, zoals knikken 11 en 12 assays orale toxiciteit <em>. Ook orale toxiciteit assays betrekking op de virulentie van toxines uitgescheiden ingebracht in het spijsverteringsstelsel van larven, terwijl de directe injectiewerkwijze richt de virulentie van gehele cellen inocula.
Het nut van de directe injectie methode zoals hier beschreven bacteriële pathogenese analyseren bewaken insect mortaliteit. Echter, deze werkwijze eenvoudig worden uitgebreid voor het bestuderen van de effecten van besmetting van het M. sexta immuunsysteem. Het insect reageert op infectie via zowel humorale als cellulaire responsen. De humorale respons omvat herkenning van bacterieel geassocieerde patronen en daaropvolgende productie van diverse antimicrobiële peptiden 7, de expressie van genen die coderen voor deze peptiden kunnen worden bewaakt na directe infectie via RNA extractie en kwantitatieve PCR 13. De cellulaire respons op infectie omvat nodulatie, inkapselen en fagocytose van ziekteverwekkers door hemocyten 6 </sup>. Om deze reacties te analyseren, kan geïnjecteerd insecten worden ontleed en gevisualiseerd door microscopie 13, 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
De directe injectie van M. sexta larven met entomopathogene bacteriën, zoals hier beschreven, dient als een eenvoudig en effectief middel om bacteriële virulentie analyseren. De methode is ook zeer aanpasbaar aan te passen verschillende proefpersonen en / of voorwaarden. Bacteriën kunnen op diverse manieren bereid voor injectie. Bij X. nematophila, wild type cellen gekweekt in voedselrijke Luria-Bertani (LB) medium tot mid-log fase zijn typisch de meest virulente, doden meeste of alle insecten binne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen het verleden leden van de Goodrich-Blair lab bedanken: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, en Youngjin Park voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation subsidie IOS-0950873 en de National Institutes of Health NRSA gemeenschap FAI084441Z.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D’Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
