אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי
Summary
שימוש מוצלח של צבעי מעקב סלולרי כדי לעקוב אחר תפקוד תא חיסוני והתפשטות כרוכה במספר שלבים קריטיים. אנו מתארים שיטות ל: 1) קבלת תווית-ing הבהיר והאחיד, לשחזור קרום עם צבעים: 2) בחירת תנאי נתוני רכישת fluorochromes ו; ו3) בחירת מודל לכמת התפשטות תאים על בסיס דילול צבע.
Abstract
צבעי ניאון מעקב סלולרי, בשילוב עם זרימת cytometry ותמונה, הם כלים רבים עצמה שבה ללמוד את יחסי הגומלין וגורלם של תאים מסוגים שונים במבחנת in vivo. 1-5 למרות שיש ממש אלף פרסומים באמצעות צבעים מעין אלה, שהחלק יישומי המעקב הסלולריים נתקלו הנפוץ ביותר כוללים ניטור של:
- גזע ורגיעה לתא אב, ריבוי ו / או בידול 6-8
- העברת אנטיגן מונע קרום 9 ו / או התפשטות תאים מקדים ו3,4,10-18
- תפקוד חיסוני תקין ומפעיל סלולרי 1,18-21.
צבעי מעקב סלולרי זמינים מסחרי להשתנות במידה רבה בכימיה שלהם ומאפייני קרינה אבל הרוב הגדול נופלים לאחת משתי כיתות המבוססות על המנגנון של תיוג הנייד שלהם. "צבעי ממברנה", מאופיינים בPKH26, הם צבעי lipophilic מאוד tמחיצה ביציבות אך אינה קוולנטית לקרומי תאים 1,2,11 כובע. "צבעי חלבון", מאופיין בCFSE, הם צבעי אמין תגובתי שיוצרים קשרים קוולנטיים יציבים עם חלבוני תא 4,16,18. בכל כיתה יש יתרונות ומגבלות משלה. המפתח לשימוש המוצלח שלהם, במיוחד במחקרים שבו צבעים ססגוניים מרובים נמצאים בשימוש כדי לעקוב אחר תאים מסוגים שונים, ולכן כדי להבין את הבעיות הקריטיות המאפשרות שימוש אופטימלי בכל כיתה 2-4,16,18,24.
הפרוטוקולים כללו כאן להדגיש שלוש סיבות שכיחות של תוצאות עניות או משתנים בעת שימוש בצבעי תא מעקב. ואלה הם:
- כישלון להשיג תיוג בהיר ואחיד, לשחזור. זוהי נקודת התחלה הכרחית לכל מחקר מעקב תא, אך דורשת תשומת לב למשתנים שונים, כאשר שימוש בצבעים בממברנה מאשר בשימוש בצבעי חלבון או ריאגנטים מחייבים שיווי משקל כגון נוגדנים.
- שילובי fluorochrome תת אופטימלייםnd / או אי הכללת פיצויי בקרות קריטיות. מעקב פלואורסצנטי הצבע הוא בדרך כלל 10 2 – בהיר 10 3 פעמים מפלואורסצנטי הנוגדן. לכן זה חיוני כדי לוודא שהנוכחות של צבע מעקב אינה פוגעת ביכולת לזהות בדיקות אחרות בשימוש.
- כישלון בהשגת כושר טוב עם תוכנת מודלי שיא. תוכנה כזו מאפשרת השוואת כמותית של תגובות פרוליפרטיביות פני אוכלוסיות או גירויים שונים המבוססות על תדר מבשר או מדדים אחרים. קבלה בכושר טוב, לעומת זאת, דורש הרחקה של מתים / למות תאים שיכולים לעוות פרופילי דילול צבע והתאמה של הנחות שבבסיס המודל עם מאפיינים של פרופיל דילול הצבע שיתקבל.
דוגמאות מובאות כאן ממחישות כיצד משתנה אלה יכולים להשפיע על תוצאות בעת שימוש בקרום ו / או צבעי חלבון לפקח התפשטות תאים.
Protocol
1. תיוג ממברנה כללי עם דאי מעקב הסלולרי PKH26 (אסמכתא 25; איור 1) השתמש בטכניקה סטרילית לצעדים 1.1-1.9. הכן ~ 10 7 תאים אנושיים דם היקפיים mononuclear או לימפוציטים (hPBMC, hPBL) באמצעות שיטה הסטנדרטית של המעבדה בתוספת של ספין XG סופי 300 כדי למזער זיהום טסיות דם. Resuspend תאים ב10 7 / המ"ל בHBSS BSA 1% ומקום על קרח, להזמין aliquot 500 μl (5×10 6 תאים) לשימוש בשלב 2. 5×10 6 תאי Place (500 μl) בצינור 12 x 75 מ"מ חרוט פוליפרופילן. לשטוף פעם אחת עם 3.5 HBSS מ"ל. בזהירות לשאוב supernatant, לא משאיר יותר מ 15-25 μl של נוזל שיורים, אך נזהר שלא להסיר תאים. השתמש בצינור זה כדי להכין את השעית תא 2x בשלב 1.4. במהלך שטיפת התא בשלב 1.2, להוסיף 0.5 מ"ל של רכב תיוג C הממס (מערכת PKH26GL) לצינור 12 x 75 מ"מ חרוט פוליפרופילן. השתמש בצינור זה להכנההם PKH26 פתרון 2x בשלב 1.5. הוסף 0.5 מ"ל של רכב תיוג C הממס לתא הגלולה השטופה מהשלב 1.2 ולשאוב ולוותר על 3-4 פעמים כדי לקבל השעית תא בודדה (2x תאים). הימנע מהיווצרות בועה ומוגזמת ערבוב, אשר עשוי להפחית את כדאיויות תא והתאוששות. מייד לאחר הכנת השעית תא 2x בשלב 1.4, להכין (4 מיקרומטר) פתרון לצבוע 2x ידי הוספת 2.0 μl של מניית 1.0 מ"מ PKH26 לצבוע באתנול (מערכת PKH26GL) לצינור C הממס המוכנים בשלב 1.3 ומערבולת כדי לפזר באופן אחיד. מייד לאחר הכנת תמיסת הצבע 2x בשלב 1.5, מהירות פיפטה השעית תא 2x משלב 1.4 לפתרון לצבוע 2x ובו זמנית לשאוב ולוותר על 3-4 פעמים לפיזור תאים לחלוטין בצבע אל תעשה:. להוסיף צבע mM 1.0 ישירות תאים; יוצק לתוך תאי 2x 2x צבע, או להוסיף תאים ל2x 2x לצבוע תוך vortexing. משום ההכתמה היא כמעט מיידית, שיטות כאלה תנבנה פחותעוצמות אחידות מאשר השיטה המומלצת (איור 2). לאחר 1 דקות, להוסיף 1.0 מ"ל של נסיוב המומת חום או +5% BSA HBSS להפסיק ספיגת צבע לתוך קרום תא. שימוש שלא מספיק חלבון סיכוני ההיווצרות של אגרגטים בצבע, אשר יכול גלולה עם תאים במהלך שלבי כביסה ולגרום לתיוג לא מכוון של תאים אחרים מציגים בניסוי. אם בינוני עם 10% חום מומת בסרום (CM) או HBSS 1% BSA הוא לשמש כמגיב התחנה, לבצע את ההכתמה בצינור פוליפרופילן 15 מיליליטר חרוטים ולהוסיף לפחות 5.0 מ"ל של ריאגנט תחנה כדי להבטיח ספיחה של כל מאוגד צבע. צנטריפוגה את התאים שכותרתו למשך 5 דקות @ ~ 400 x גרם. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להסיר תאים. שטוף את הכדור פעמים עם 4 מ"ל של סנטימטר או 1% BSA HBSS, פיזור הגלולה הרבה לפני recentrifugation. כדי למזער את השפעת הלוואי של הצבע adsorbed על קירות צינור ולמקסם את יעילות כביסה, להעביר את התאים לצינור פוליפרופילן טרי לאחר firesuspension RST. הערה: במידה מספקת תאים מוכתמים יפגינו גוון ורוד מובהק בגלולה. Resuspend תא הגלול השטופה בBSA 1.0 המ"ל HBSS 1%. ספירת התאים, לקבוע התאוששות תא, ולהתאים את עוצמת קול כדי לתת ריכוז סופי של 10 7 / מ"ל. עם שאיפה זהירה, התאוששות תא צריכה להיות ≥ 85%. אם התאוששות תא היא <70%, לקבוע את הגורם לפני שתמשיך הלאה. לסגת aliquot 150 μl (1.5×10 6 תאים) ומניח על קרח לשימוש בשלב 2. 2. הכנה של פקדי הגדרת כלי וAssay (טבלה 1) 50 μl aliquot (5×10 5) של תאי בתוליים מהשעית התא נשמרת בשלב 1.1 לכל אחד מחמישה צינורות 1.8 מ"ל Eppendorf: 1, 3, 4, 5, ו 7. 50 μl aliquot (5×10 5) של תאי PKH26 pos משלב 1.9 לכל אחת משלושה צינורות: 2, 6 ו 8. הוסף 10 IgG בלוק μl (100 מיקרוגרם / שפופרת של IgG; ראה טבלה של ריאגנטים) לצינורות 1-8ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת הסביבה (20-25 ° C). הוסף כמות להרוות של הנוגדן (IES) שצוינה בטבלת המס '1 לצינורות 4, 5, 7 ו 8 ודגירה כל הדגימות (צינורות 1-8) למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה ומוגנת מפני אור. הוסיפו 1.5 מ"ל של HBSS BSA 1% לכל הדגימות, גלולת התאים על ידי צנטריפוגה (5 דקות @ 400 XG) ולשטוף פעם אחת עם 1.5 מ"ל של 1% HBSS BSA, עם שאיפה זהירה, כדי למנוע אובדן תא. Resuspend כל דגימה ב500 μl של HBSS BSA 1%. אם נדרש לדוגמאות כדי להיות מנותח על cytometer, להעביר לצינור 12 x 75 מ"מ עגול תחתון. הוסף 10 μl של 100 מיקרוגרם / מ"ל 7-AAD מנייה פועלת ביום (ראה טבלה של ריאגנטים) עד 3 צינורות, 6, 7 ו 8 כפי שמצוין בטבלת 1. לדגור על קרח למשך 30 דקות לפני השימוש בהתקנת cytometer זרימה ואימות מכתימה (שלב 3). 3. התקנת Cytometer זרימה ואימות כתמים ודא שcytome הזרימהter פועל באופן תקין, תוך שימוש בנהלים שנקבעו במעבדה לבקרת איכות יומית. ודא שאותות בקלות יכול להתגלות בכל חלון ספקטרלי לשמש, ושתגובות גלאי הם ליניארי יחסיות לאותת עצמה בחלון שישמש לניטור התפשטות 14. לרכוש FSC לעומת SSC נתונים עבור 1 Tube באמצעות סולמות תצוגה ליניארית. התאם ההגברה של כל גלאי כזה שאוכלוסיית הלימפוציטים נופלת ברבע השמאלי התחתון של עלילת הנקודה, לא את קנה המידה בשני פרמטרים, ולא יופרע בשל סף. איסוף נתוני FSC לעומת SSC ungated לכל הדגימות בשלבים 3.3-3.7. לרכוש נתונים עבור 1 תחתי, ללא שימוש בפיצוי צבע וסולמות תצוגת לוגריתמים לכל 4 גלאי הקרינה. התאם מתח הגבוה של כל גלאי (HV) למקום autofluorescence של לימפוציטים בתוליים בקנה מידה עם מעט / אין תאים מצטברים בערוץ הראשון. גדר גבול ניתוח עבור כל היסטוגרמהמקביל ל2% המבריקים של תאי בתוליים. שימוש ללא פיצוי צבע ואת הגדרות HV הוקם בצעדי 3.2 ו 3.3, איסוף נתונים לTube 2, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. לגלאי משמש לניטור PKH26 פלואורסצנטי, לוודא שכל תאי PKH26 pos מופיעים בקנה המידה כמו שיא סימטרי יחיד בעשור ה -4 -3, עם מעט / לא תאים בערוץ האחרון. אם יש פסגות מרובות או צורת שיא מוטה, חזור על שלב 1 עם תשומת לב קפדנית למזעור המלח וטכניקת ערבוב (איור 2). אם יש צורך, להתאים את ריכוז צבע. שימוש בהגדרות שנקבעו בשלב 3.3, ואיסוף נתונים לTube 3, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. לגלאי משמש לניטור פלואורסצנטי 7-AAD, לוודא שתאי 7-AAD pos נופלים מעל גבול 2% הוקם בשלב 3.3 (כלומר, שתאים שאינם בנות קיימא נפתרים גםמתאי קיימא 7-AAD נג). שימוש בהגדרות שנקבעו בשלב 3.3, ואיסוף נתונים לTube 4, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. ודא שתאי CD8 pos נפתרים גם מתאי בתוליים (כלומר, נפילה מעל גבול 2% הוקם בשלב 3.3 לגלאי FITC). חזור עם Tube 5 ולוודא שתאי CD8 pos נפתרים גם מתאי בתוליים (כלומר נפילה מעל גבול 2% הוקם בשלב 3.3 לגלאי APC). הגדרות באמצעות הוקמו בשלב 3.3, ואיסוף נתונים לצינורות 6, 7 ו 8, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. השתמש במצב של רשימת הקבצים שנאספו לצינורות 1-5 ותוכנת פיצויי צבע כדי לקבוע צבע חפיפת מטריצה עבור כל fluorochrome בגלאים המשמשים לניטור השלושה fluorochromes האחר. החל מטריצה זו לקובץ מצב הרשימה לדוגמה 6 ולוודא שהנוכחות של PKH26 מעבדהeling אינו משנה את היכולת לזהות 7-AAD תאי pos. להחיל את צבע חפיפת מטריצה מהשלב 3.8 לקובץ מצב הרשימה לדוגמה 7 ולוודא ש:) 3 subpopulations נפתר היטב (CD3 CD4 נג נג, CD3 CD4 pos נג וCD3 CD4 pos pos) ניתן לזהות על FITC לעומת עלילת APC נקודה וגם ב) הנוכחות של אנטי CD3-FITC ואנטי CD4-APC אינו משנים את היכולת לזהות 7-AAD תאי pos. אם הנוכחות של-CD3-FITC אנטי משנה את הגבול העליון של 2% בנתונים שנאספו על PKH26 הגלאי, להתאים מחדש את הגבול כפי שנדרש. החל מטריצת צבע החפיפה משלב 3.8 לקובץ מצב הרשימה לדוגמה 8. אם הנוכחות של PKH26 תיוג משנה את גבול 2% לFITC, 7-AAD או גלאי APC מאלו שנקבעו באמצעות שלט autofluorescence בשלב 3.3, להתאים מחדש את הגבול (ies) לפי צורך באמצעות Tube 7 של הטבלה 1 ולוודא שהוא עדיין אפשר distinguish CD3 CD4 pos pos, CD3 CD4 pos נג, וCD3 CD4 תאי NEG NEG באמצעות הגבול המתואם (IES). 4. בחירה במודל הפצת נשק לניטור חלוקת תאים על ידי דילול דיי לקבוע את המרווח בין הדורים, וזה תלוי במספר הערוצים ועשורי לוגריתמים על cytometer. למכשירים דיגיטליים, ערך זה, בדרך כלל 4 או 5 שנים, נקבע במספר הפחים במעבד האותות הדיגיטלי. במכשירים אנלוגיים, שבו מספר העשורים הוא לעתים רחוקות כל מספר, מודלים מדויקים דורשים מספרם המדויק של עשרות שנים שתיקבענה באופן ניסיוני. כדי לעשות זאת, נתונים מתערובת של חרוזי ניאון מכויל עם עוצמות יחסי יצרן הוקצו נרכשים באותן הגדרות המתח גבוהות גלאים המשמשות בניסוי. העמדה של פסגות החרוזים מאפשרת כיול של סולם הלוגריתמים במונחים של intמגוון ensity לעשור יומן. באופן ספציפי, זה נעשה על ידי קשירת קשר מספר הערוץ לכל סוג חרוז נגד היומן של ערך היצרן שהוקצה. שיפועו של קו ישר בהתאמה מיטבית לערכי נתוני החרוזים נותן את מספר יחידות עצמה יחסיות לכל ערוץ. מוכפל במספר הערוצים, ערך זה יהיה אז את מספר עשורי יומן לקנה מידה המלא, שממנו את מספר הערוצים מקבילים לירידה כפולה בעצמה (כלומר, מרווח בין דור בת) ניתן לחשב 14. להחליט אם להשתמש במרווח קבוע בין הדורים או כדי לאפשר את המרווח לצוף. הגדרה סטנדרטית (קבוע) תשתמש בערך המרווח שנקבע בשלב דורי 4.5 להקצות את מיקומו של כל דור, והוא בדרך כלל בשימוש בעת היסטוגרמה חסרת פסגות נבדלות. הגדרת תהלוכה מאפשרת לכל עמדת שיא דורות שתקבע את צורת היסטוגרמה ובדרך כלל בשימוש בעת distinguishablדואר פסגות דורות ניכרות. להחליט אם להשתמש ברוחב שיא קבוע לכל הדורים או ברוחב משתנה. רוחב קבוע משתמש SD מחושב למדגם השליטה unstimulated למודל כל הדורים ובדרך כלל נבחר כאשר הדגימה חסרת פסגות דוריים הנבדלים. רוחב צף מאפשר לתכנית באופן עצמאי להשתנות SD עבור כל דור, והוא טוב ביותר בשימוש עם פסגות דוריים הנבדלים. הפעלת תכנית שמכילה מודול ניתוח התפשטות (כאן בגרסת ModFit LT 3.3). טען את קובץ מגורה PKH26 pos מהנתונים שנקבעו כדי להיות מנותחים (למשל, תרבות מגורה 96 שעות של תאי PKH26 pos counterstained כלTube 8 בלוח 1). בחר את הפרמטרים לניתוח, במקרה זה PKH26 (585/42) המגודר בקיימא (7-AAD נג) CD3 ימפוציטים pos וFSC לעומת SSC להוציא פסולת קטנה ואגרגטים גדולים (איור 3). בהגדרההאזורים אלה להיות זהירים, כדי לכלול את אזור הפיזור קדימה הגבוה שבו נמצאות בדרך כלל תקיעות ולציין כי CD3 ביטוי יכול להיות למטה מווסת בתרבויות מגורה. יצירת מודל הפצה חדש באמצעות אשף הפצת הנשק. שימוש בקובץ הנתונים הפתוח (כרטיסייה התחל), טען את הקובץ מלא unstimulated PKH26 pos ולהגדיר את מיקומו של ערוץ השיא בהפצה המקבילה לתאים מחולקים ההורים. לנתח את הקובץ לשליטת unstimulated PKH26 pos, וציין את הערכים עבור מיקום שיא הורי ורוחב (סטיית התקן). אם רוחב שיא קבוע (SD) הוא רצוי, לבדוק הנעילה SD. טען PKH26 neg השליטה (למשל, 96 שעות של תרבות PKH26 תאי NEG counterstained כלTube 7 בטבלה 1). התאם את מספר הדורים על ידי קביעת השיא לערוץ דור dimmest לעיל PKH26 neg השליטה. זו קובעת נוmber דורי בת המודל יכול להתאים במדויק והוא בדרך כלל 6-9 דורות. פתח את קובץ הנתונים למדגם המגורה (למשל, תרבות מגורה 96 שעות של תאי PKH26 pos counterstained כלTube 8 בלוח 1) ומאשר כי האזורים לתפקיד ההורי השיא וSD כהגדרתו בשלב 4.7 יישארו ללא שינוי. אם מרווח בין דורות קבוע הוא רצוי, בחר באפשרות מודל סטנדרטית, אחרת בחר הצפה האופציה. לנתח כל קובץ ניסיוני בערכת הנתונים, תוך שימוש באותו המודל שהוגדר בשלב 4.9. התאמות קלות בעמדת שיא ההורים עשויות להיות נחוצות לכושר הטוב ביותר כהגדרתו הן מבחינה ויזואלית ועל ידי ירידת ערך צ'י המרובע (RCS). הקלט את מדדי ההפצה הרצויה כתוצאה מההתאמה הטובה ביותר עבור כל קובץ ניסוי בערכת הנתונים. לתיאור מקיף של מדדים אפשריים לראות סימוכין. 22.
Representative Results
צבעי ממברנה כמו PKH26 כתם על ידי מחיצות כמעט מיידיות לקרומי תאים ולא על ידי תגובה כימית (לCFSE) או מחייב שיווי משקל (לנוגדנים). חוסר תשומת לב לנושאים הקריטיים המתוארים באיור 1 עלול לגרום לכתמים כהים או הטרוגנית מהסוג שמוצג באיור 2. בניגוד לכך, שימוש בתנאי התיוג אופטימיזציה (1 איור, טבלה 2) תוצאות בהפצות הומוגניות בהירות המתאימים למגוון רחב של יישומי מעקב סלולרי כולל ניטור חלוקת תא המבוסס על דילול צבע (איור 3). תאים / מתים מלח מאבדים כמויות משתנות של צבע מעקב, אשר יכול להרחיב ו / או עוצמות דור בת מתעקמות ולסבך דוגמנות התפשטות מבוססת על דילול הצבע 3,4,16,18. שימוש בצבע כדאיות לכן מומלץ בעת איסוף נתוני דילול צבע בתנאים שבו יכול להיות מראש מספר משמעותי של תאים מתיםנשלח, כגון תרבויות מגורה (איור 3) או דגימות מבוגרות יותר (איור 4). בגלל מעקב תיוג לצבוע בדרך כלל נותן עוצמות קרינה כמה סדרי הגודל גדול יותר מimmunophenotyping, חשוב לכלול פקדי פיצוי מתאימים (טבלה 1) וכדי לוודא שהנוכחות של מעקב צבע לא לפגוע ביכולת לפתור נוגדני תאים חיוביים ושליליים (איור 4). כדי למנוע את הצורך בפיצוי צבע מוגזם, עדיף למקם fluorochrome בהיר, או אחד שלא נמצא בתאים בעלי עניין כגון צבע נשלל על ידי תאים חיים, בערוץ ספקטרלי (הים) בסמוך לצבע המעקב (האיור 4 א & B vs. 4C & D). בעת שימוש בתוכנת מודלי שיא לכמת היקף ההתפשטות, קבלת התאמה טובה דורש התאמת הנחות במודל למאפיינים של פרופ דילול הצבעIles להיות מנותח (איור 5 ולוח 3). עם בחירה המתאימה של צבעים וריאגנטים מעקב כדאיות, אפשר גם לאפיין תגובות פרוליפרטיביות באוכלוסיות לימפוציטים מרובות בו זמנית. לדוגמה, כפי שמודגם באיור 6, תוספת של צבע מעקב 2 מפשטת אפליה בין תאי T רגולטוריים (מסומן בקלרט CellVue) ותאי T מפעיל התרבו מאוד (מסומן בCFSE) ומספקת פירוט רב יותר על יחסי הגומלין שלהם מאשר ניתן היה להשיג באמצעות תיוג 3 H-תימידין 18,27. איור 1. פרוטוקול כללי קרום תיוג עבור PKH26, PKH67 וצבעי CellVue. מחיצות של צבעי lipophilic מאוד אלו לmembra תאנס מתרחש בעצם מייד עם הערבוב עם תאים כאשר הצביעה מתבצעת ברכב C הממס ללא מלח ספק למקסם את מסיסות צבע ויעילות כתמים. כפי שמסוכם בשרטוט זה על תיוג קרום כללי עם PKH26, כתמים בהירים, אחידים ולשעתק לכן מתקבלים בקלות על ידי: 1) צמצום הכמויות של חלבון ו / או מלחים להציג בשלב הצביעה ו2) שימוש בטכניקת ערבוב המבטחת פיזור הומוגני מהיר של תאים בצבע (כלומר, בו זמנית חושף את כל התאים לאותו הריכוז של צבע). איור 2. השפעת הכתמים על תנאי PKH26 הפצות קרינה (נדפס ממס. 18). לשכפל דגימות של U וגריתמית גדל, התרבותי937 תאים הוכתמו PKH26 (ריכוזים סופיים: 1 x 10 7 תאים / מ"ל, 12-15 מיקרומטר PKH26) עבור 3 דקות בטמפרטורת הסביבה, עם או בלי ערבוב מיידי עם התוספת של תאי 2x 2x לצבע. לאחר שטיפה, תאים מוכתמים נותחו על cytometer Beckman Coulter ציאן זרימה באמצעות הגדרות מכשיר קבועות היסטוגרמה 1:. שליטת כתם עם מתח הגלאי PKH26 מותאמת למקום את כל התאים בקנה מידה בעשור הראשון עם כמה / לא תאים מצטברים בערוץ הראשון. היסטוגרמה 2: צביעה בצבע 15 מיקרומטר באמצעות תוספת של תאים ל2x 2x לצבוע עם ערבוב מיידי הביאה צבעוני בהירה, homogenously, אוכלוסייה סימטרית של תאים שהונחו בעשור הרביעי, עם מעט / אין תאים המצטברים בערוץ האחרון (= gMFI . 2548, GCV = 26.2%) היסטוגרמה 3: צביעה בצבע 15 מיקרומטר באמצעות תוספת של תאי 2x 2x לצבע אך ללא ערבוב מיידי הביאה לעצמה מופחתת וקורות חיים רחבים יותר (gMFI = 505 , GCV = 116%) כמו גם subpopulation במעומעם מוכתם, אולי כתוצאה מירידה של תאים חלקו על הקיר של הצינור ולא לפתרון לצבוע 2x היסטוגרמה 4:. שגיאה מכתימה הוביל עד 3 μl של צבע האתנולית מרוכז מנייה להתווסף ישירות לתאים ב2x C הממס ללא ערבוב נוסף במקום שמשמש להכנת פתרון לצבוע 2x בממס ג זה הביא ריכוז צבע סופי של 12 מיקרומטר אבל נתנה מכתים מאוד עמום והטרוגנית (gMFI = 32.9, GCV = 1020%). נצפה זכות להטות ככל הנראה משקף את ההשפעות המשולבות של: i) העניות ערבוב בשל תא נרחב נבדל וכרכים לצבוע; וii) העובדה שהתאים הקרובים ביותר לנקודה מחלק הצבע יהיו חשופים לריכוז גבוה יותר של צבע מאלו רחוקים משם. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. מחדש 3 "src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg "fo: תוכן רוחב =" 4.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/> איור 3. השימוש בבדיקת כדאיות מפשט gating של פרופילי שגשוג תאי T hPBMC תויג עם PKH26 (ריכוז סופי תא: 3×10 7 / מ"ל; ריכוז צבע סופי: 10 מיקרומטר).. לאחר 96 שעות לתרבות בנוכחות (גירוי) או העדרה (unstimulated) של אנטי CD3 ו-IL-2, תאי counterstained עם אנטי CD3-FITC, אנטי CD19-APC ו7-AAD, ונותחו על cytometer FACSCalibur זרימה (ראה סימוכין 13 לפרטים נוספים). פיצוי צבע בוצע בעת רכישת נתונים באמצעות מעגלי פיצוי קשיחים. מידת ההתפשטות הייתה במתכונת כפי שמתוארת בשלב 4 באמצעות אשף ההפצה בModFit LT3.3. נתונים מPKH26 neg השליטה (1 שולחן, Tube 7) הם כיסו לעיון (היסטוגרמות מלאה אפורה בעמודה 3). Viabilities לunstimulated וSTIתרבויות mulated היו 76% ו 62% (נתוני ungated לפנלי A ו-B, בהתאמה). לוח א PKH26 תאים מוכתמים תרבית ל96 שעות במדיום היו מגודרים לכלול (7-AAD נג) תאי CD3 pos קיימא (R1). בנוסף להכללת הנוגדן ושער הדרת 7-AAD מת תא, פיזור פיזור קדימה (FSC) לעומת צד (SSC) שער (R2) שמש להוצאת פסולת ואגרגטים. שים לב להיעדרות של תאים מתים בעלילה האחרונה בלוח זה. המודל המתאים ביותר לפרופיל PKH26 ההתפשטות (עמודה 3) נתן שיא יחיד עם RCS = 2.1 (6 תורמים, לוח 3), המעיד על סימטריה טובה, והיה בשימוש כדי להגדיר את העמדה ההורית ומתחיל רוחב שיא עבור ניתוח של המגורה המדגם ממערך נתונים זה (לוח ב '). לוח ב aliquot לשכפל של PKH26 תאים מוכתמים היה מתורבת עם אנטי CD3 וIL-2 עבור 96 שעות ומגודרות באותה הצורה כמו בלוח א מודל עם עמדת שיא צפה ורוחב שיא צף נתן בכושר הטוב ביותר למידע זה עם RCS = 1.3 (6 תורמים, לוח 3). לוח ג אותו קובץ הנתונים, כמו בלוח נותח ללא שימוש בנתוני 7-AAD. כאשר FSC עיקרי לעומת SSC שמש באופן חלקי להוצאת תאים מתים ואגרגטים (R2) ושער שני לבחור CD3 אירועים חיוביים (R3), אוכלוסייה קטנה של שאריות תאים מתים נשארה (0.2% מאירועים מגודרים). המודל המתאים ביותר נתן שיא יחיד עם RCS = 2.2. לוח ד אותו קובץ נתונים כמו בלוח ב 'היה מגודר כבלוח ג שים לב האוכלוסייה השיורית הגדולה יותר של תאים מתים במדגם המגורה (1.29% מאירועים מגודרים) לאסטרטגיה זו gating. מודל הכושר הטוב ביותר היה אחד עם עמדה צפה שיא ורוחב שיא צף (RCS = 1.3). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. ig4.jpg "fo: תוכן רוחב =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/> איור 4. אפקט של בחירת fluorochrome וריכוז לצבוע ביכולת ימפוציטים immunophenotype כותרתו עם PKH26. HPBMC בודדו מדם של 24 שעות וישן תווית עם PKH26 כפי שמתואר בשלב 1, למעט שמכתים בוצע בתחתית 12 x 75 מ"מ עגולה צינורות קלקר ולא 12 75 צינורות פוליפרופילן חרוטי מ"מ x. מייד לאחר הסימון בPKH26, תאי counterstained עם ריאגנטים immunophenotypic וכדאיות שצוינו, ונתחו בcytometer זרימת LSRFortessa באמצעות אסטרטגית gating של 3A איור והתצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-(488 ננומטר); SSC -(488/10 BP), FITC-(530/30 BP); PKH26-(575/26 BP); 7-AAD-או PerCP-(695/40 BP). 640 ננומטר ליזר: APC-או TOPRO-3-(670/14 BP). פיצוי צבע בוצע בעת רכישת נתונים באמצעות תוכנת דיווה BD. "אוטומטי"מציין autofluorescence של השליטה ללא נוגדנים בחלון ספקטרלי הרלוונטי (APC לפנלי A ו-B, PerCP לפנלי C ו-D). נתונים מPKH26 neg השליטה (1 שולחן, Tube 7) הם כיסו לעיון (היסטוגרמות מלאה אפורה, עמודה 5). viabilities לאחר הצביעה היו דומים בכל הדגימות (88-92%). תאי לוח א שכותרתו עם PKH26 בריכוז סופי של 2 מיקרומטר היו counterstained באמצעות אנטי CD3-FITC, אנטי CD4-APC, ו7-AAD ( צינור 8 מתוך לוח 3). לאחר gating על קיימא (7-AAD נג) CD3 ימפוציטים POS (טור 1) והרחקה של פסולת ואגרגטים המבוססים על FSC וSSC (ראה איור 3 א), PKH26 עצמה הוערכה בשילוב עם CD4 APC (עמודות 2 ו 3). בין אם ללא פיצוי (טור 2) או פיצוי (טור 3), שילוב fluorochrome זה הביא רזולוציה טובה בין תאי CD4 pos T מסוג CD4 ותאי T NEG), כפי שאומת גם על ידי אףntibody, בקרת autofluorescent (Tube 6 מתוך טבלה 1; טור 4) ואת העלילה בשני הצבעים של CD3 vs. CD4 (טור 6). לוח ב. באמצעות אותו שילוב fluorochrome כבלוח, אבל הגדלת PKH26 הריכוז הסופי של 4 מיקרומטר לא להשפיע לרעה על היכולת לפתור תאי CD4 pos T מסוג CD4 תאי T NEG. לוח ג aliquot לשכפל תאים שכותרתו באופן עצמאי עם PKH26 בריכוז סופי של 2 מיקרומטר היה counterstained באמצעות אנטי CD3-FITC, אנטי CD4-PerCP, וTOPRO-3. לאחר gating ב( TOPRO-3 נג) CD3 ימפוציטים קיימא POS (טור 1) והרחקה של פסולת ואגרגטים המבוססים על FSC וSSC (ראה איור 3 א), PKH26 עצמה הוערכה בשילוב עם אנטי CD4-PerCP (עמודות 2 ו 3). חפיפה ספקטרליים משמעותית של PKH26 לערוץ PerCP באה לידי ביטוי בנתונים ללא פיצוי (עמודה 2), ורזולוציה בין PKH26 CD4 pos <sup> CD4 אירועי PKH26 pos pos NEG הוא שולי ולאחר הפיצוי מוחל (השווה טור 3 עם אף נוגדן השליטה, autofluorescent המובאת בטור 4). לוח ד כאשר PKH26 ריכוז גדל ל 4 מיקרומטר, זה כבר לא אפשרי להשתמש בשילוב של חפיפת fluorochrome Spectral לוח ג מPKH26 לערוץ PerCP עולה עוצמת האות מסוג CD4 (עמודה 2) וCD4 pos PKH26 אירועי pos כבר לא ניתן לפתור מסוג CD4 תאי NEG PKH26 pos T (עמודה 3 לעומת. טור 4). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. איור 5. השפעה של בחירה במודל הפצה על. טיב ההתאמה לפרופילי דילול הצבע hPBMC תויגו עם PKH26 (ריכוז סופי תא: 3×10 7 / מ"ל; ריכוז צבע סופי: 10 מיקרומטר). לאחר 96 שעות לתרבות בנוכחות (גירוי) או העדרה (unstimulated) של אנטי CD3 ו-IL-2, תאים נקצרו counterstained עם אנטי CD3-FITC, אנטי CD19-APC ו 7-AAD ונותח על FACSCalibur cytometer זרימה (ראה התייחסות לשיטות מפורטות 13). פיצוי צבע בוצע בעת רכישת נתונים באמצעות מעגלי פיצוי קשיחים. לוח. פרופיל PKH26 העצמה מתרבות unstimulated 96 שעות לתורם 5, מגיב מתון, היה מגודר כפי שמוצג באיור 3 א ומשמש כדי לספק למניעת הפצת נשק ModFit אשף עם אומדן ראשון של מיקום ורוחב לשיא מייצג תאים הוריים מחולקים B. לוח. פרופיל PKH26 העצמה מהתרבות מקבילה מגורה 96 שעות נותח באמצעות האומדנים החל מלוח A ו 4 שילובים שונים של הגדרות 'הפצה האשפית ", המתאימים לעוצמות שיא קבועים או משתנים, ורוחב קבוע או צוף שיא לדורי בת רצופים כפי שמוצג. כפי שמסוכם בטבלה 3, המודל שנתן בכושר הטוב ביותר לנתונים הנצפים (הנמוך ביותר צ'י המרובע המופחת; RCS) היה שילוב "המרחף / צף" שבו לא רק עמדות שיא, אלא גם סטיות תקן של פסגות דור בת הורשו כדי להשתנות (RCS = 1.5). אותו המודל נתן בכושר הטוב ביותר עבור 6 תורמים, מגיב גבוה (האיור 3B ולוח 3). איור 6. תוספת של צבע מעקב תא שני מפשטת אפליה בין תאי T מפעיל והרגולציה בassay דיכוי הזרימה cytometric(מעובד ממס 18). ימפוציטים Monocyte מדולדלים-הוכנו ממסנני leukapheresis TRIMA הוכתמו אנטי CD127-PE, אנטי CD4-PE-Cy7, ואנטי CD25-APC וזרימה מוינו לאוכלוסיות של מפעיל (טף. CD4 pos CD127 בהירים CD25 העמום), רגולטורים (Treg; CD4 pos CD127 העמום CD25 pos), ואבזר (CD4 NEG) תאים. תאי Treg ממוינים כותרתו עם קלרט CellVue (ריכוז סופי תא:;: 1 מיקרומטר 1×10 6 / מיליליטר ריכוז צבע סופי) טף מסודר ומתויג עם CFSE (ריכוז סופי תא: 5 × 10 7 / מ"ל; ריכוז צבע סופי, 5 מיקרומטר) היו שיתוף תרבית ביחסים משתנים בנוכחות של תאי אבזר אנטי CD28 אנטי CD3, ומוקרן. לאחר 96 שעות, תרבויות נקצרו, counterstained עם אנטי CD4-PE-Cy7 ויולט ניתן לתקן LIVE / DEAD, ונתח בcytometer זרימה LSRII ופיצוי צבע בוצע בזמן הנתונים acquisition באמצעות BD דיווה תוכנה (ראה סימוכין 18 לפרטים כוללים בקרות פיצויים). את מדדי הפצת הנשק לטף וTreg היו מודל כפי שמתואר בשלב 4, באמצעות אשף ההפצה בModFit LT3.3. נקודתי נתונים בפנלי B ו-C מייצגות ± סטיית תקן הממוצעת של דגימות 1 שלושה עותקי נתונים מייצגים א לוח מוצגים לאחד משלוש דגימות בשלושה עותקים Treg:. יחס טף של 0.25:1. מגיבים יולט ניתן לתקן LIVE / DEAD שמש להוצאת תאים מתים (עלילת R1, שמאלית העליונה; תאי אבזר = אדום חום, טף nonviable = אפור וTreg nonviable = אדום) מכל מגרשי נתונים האחרים. מכתים קלרט CellVue שמש להבחין Treg קיימא (R4, עלילה ממש מרכז; הכחול) מקיימא אבל מאוד התרבה טף (R5, עלילה ממש מרכז; הירוק). פרופיל של פרמטר אחד לריבוי CFSE טף (חלקה שמאלית תחתונה) נוצר על ידי gating על תאים היו CFSE pos (R5), CD4 pos (R3), בת הקיימא (לא R1), והיה לי הלימפוציטים scמאפייני atter (R2). פרופיל של פרמטר אחד CellVue קלרט התפשטות לTreg נוצר על ידי gating על תאים היו CellVue קלרט pos (R4), CD4 pos (R3), בת הקיימא (לא R1), ובעל תכונות פיזור הלימפוציטים (R2). שים לב לאזור הלימפוציטים הנדיב (R2) המוגדר לכלול תקיעות הלימפוציטים. שימו לב גם כי מספר כולל של תאים שנאספו תלוי באוכלוסיית התדר הנמוכה ביותר של ריבית. בניסוי שבו תרבות של תאי האוכלוסייה של ריבית עשויה להיות מפוזרת על פני טווח רחב של עוצמות המייצגות עד שבעה או שמונה דורות מספר גדול של תאים צריכים להיות שנאסף במטרה בצורה המדויקת למודל ולחשב את מספר התאים בכל דור ודור. כאשר לומדים תאים נדירים, ייתכן שיהיה צורך פשוט לרוץ צינור המדגם כמעט היבש כדי לאסוף את המספר המרבי האפשרי של אירועים. לדוגמא שמוצגת כאן, עושה את זה הביא בסך של 25,000 ~ אירועים, מתוכם 11,923 היו טף (למניעת הפצת נשקיndex 3.85) ו1380 היו Treg (הפצת אינדקס 1.83). לוח ב 'כצפוי, הגדלת חלקה היחסית של הווה Tregs בשיתוף תרבויות הובילו לדיכוי רב יותר של התפשטות תאי טף. תוצאות דומות התקבלו גם עם (קו מוצק) CellVue קלרט מוכתם או Treg לא כתם (קו מקווקו), המציין כי בצביעה לצבוע מעקב קלרט CellVue לא השפיע Treg עצמה. לוח ג Treg יחסית anergic ו, כצפוי, עשה לא מתרבה כאשר דגרו ב- CD28 אנטי אנטי CD3, ותאי אבזר בהיעדר תאי טף (Treg: יחס של טף 01:00). עם זאת, כחלק מהווה הטף בשיתוף תרבויות גדל (כלומר, כTreg: יחס טף ירד), מידת התפשטות Treg גם גדלה. ברי השגיאה בדרך כלל הגדולים יותר לנתונים הללו, לפחות בחלקו משקפים את המידה המוגבלת של התפשטות, והובילו למספר קטן יותר של אירועים ביחס לטף ויותר בטוחים שנאספוty בדוגמנות את מספר התאים בכל דור ודור. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. מס 'צינור (מטרה) PKH26 נוגדן (ies) 7-AAD 1 (התקנה, פיצויים) – – – 2 (התקנה, פיצויים) + – – 3 (הגדרה, פיצויים) – – + 4 (פיצוי) – CD8-FITC ב – 5 (פיצוי) – CD8-APC ב – 6 (אין שליטת אב) + – + 7 (לא קון לצבוע מעקבטרולופ) – CD3-CD4 FITC-APC או CD19-APC ג + 8 (T0 שליטה) + CD3-CD4 FITC-APC או CD19-APC ג + . טבלת 1 התקנת כלי בקרת Controls רשום מתאימים לבדיקת 4-T מסוג CD4 צבע תא התפשטות ניטור באמצעות:. PKH26 (התפשטות צבע), CD3-FITC (סמן תא מחבת-T), CD4-APC (T-helper סמן תא), 7-aminoactinomycin D (7-AAD; הרחקת תאים מת) ב תחליפים טובים יותר לCD3-CD4 וFITC-APC (יכולת טובה יותר לזהות שגיאות פיצויים) ג איור 3:.. CD3-CD19 FITC ו- APC. איור ד 4: CD3-CD4 וFITC-APC. סוג התא ריכוז תא סופי ריכוז דיי סופי </ Strong> עיון hPBMC ב 1 x 10 7 / מ"ל 2 מיקרומטר PKH67 10,17 5 X 10 6 / מ"ל 2 מיקרומטר PKH26 12 3 x 10 7 / מ"ל 10 מיקרומטר PKH26 13 5 X 10 7 / מ"ל 30 מיקרומטר PKH26 18 1 x 10 6 / מ"ל קלרט CellVue מיקרומטר 1 ג 18 3 x 10 7 / מ"ל 4 קלרט CellVue מיקרומטר 13 5 X 10 7 / מ"ל קלרט CellVue 5 מיקרומטר 18 תאים בתרבית 5 x 10 5 / מ"ל 0.1 מיקרומטר PKH26 (1 ° תאי חלב) 8 1 x 10 7 / מ"ל 15 מיקרומטר PKH26 (U937) 18 1 x 10 7 / מ"ל 12.5 מיקרומטר -15 PKH26 (U937) 15 1 x 10 7 / מ"ל 1 מיקרומטר PKH67 (K562) 18 1 x 10 7 / מ"ל מיקרומטר 1 PKH67 (שורות תאי T) 9 1 x 10 7 / מ"ל 10 קלרט CellVue מיקרומטר (YAC-1) 23 תנאים מכתימים. טבלה 2 ללא perturbing ממברנה-Dye. עיבוד ומתעדכן ממס. 18. ב לשטוף מהירות נמוכה (300 XG) שמש כדי למזער את זיהום טסיות דם. תאי Treg C (CD4 ימפוציטים תזרים ממוין pos pos CD127 CD25 neg). הגדרות מודל <td colsפאן = "6"> תוצאות מודל תורם טיפול מיקום שיא SD קבוצת הורים SD הורים # של פיקס מצויד RCS PI PF 5 Unstimulated לצוף לצוף 209 4.5 1 5.1 1.0 0 5 מומרץ קבוע קבוע 209 <td> 4.5 7 35 3.9 31 5 מומרץ לצוף קבוע 209 4.5 8 19 4.3 30 5 מומרץ קבוע לצוף 209 9.2 6 1.9 3.8 30 5 מומרץ לצוף לצוף 209 9.0 7 1.5 3.7 29 6 Unstimulated לצוף לצוף 205 4.0 1 2.1 1.0 0 6 מומרץ קבוע קבוע 205 4.0 6 42 6.6 60 6 </ Td> מומרץ לצוף קבוע 205 4.0 7 12 7.4 60 6 מומרץ קבוע לצוף 205 8.6 6 6.9 6.8 62 6 מומרץ לצוף לצוף 205 6.5 6 1.3 6.5 59 לוח 3. השפעת מודל הפצה על טיב ההתאמה (RCS) ומדדי הפצת נשק. מכתים דוגמה, איסוף נתונים וgating כמתואר באיור 3 א & B.
Discussion
השיטות שתוארו כאן הן אלה שנמצאו במעבדות בשילוב שלנו באופן מהימן ביותר לתת תוצאות אופטימליות לתיוג hPBMC שימוש בצבעים בממברנה 13,16,18 ולphenotyping הלימפוציטים משנה ומעקב אחר התפשטות שימוש או קרום או צבעי חלבון 2,11,13,16, 18. כפי שמתואר באיורי 1 ו 2, תיוג אחיד הבהיר ביותר מושגת בקלות על ידי הגבלת הנוכחות של מלחים פיסיולוגי ובאמצעות טכניקת ערבוב כי תוצאות בחשיפה מהירה ואחידה של כל התאים לאותו הריכוז של צבע. בגלל צביעה עם צבעי קרום מתרחשת על ידי מחיצות לתוך bilayer השומנים בדם, יתר משתנים שמשנים את ריכוז צבע חופשי יכול גם להשפיע יעילות תיוג. לדוגמה, סימון בתוצאות צינורות קלקר תחתון עגולות בשטיפה פחות יעילה של מלחים לפני resuspension ב-C הממס וגם בריכוז צבע חופשי מופחת בשל ספיחה לצבוע על קירות צינור, בעיקרבריכוזים נמוכים יותר צבע. שני הגורמים נוטים לתת הפצות מכתים רחבות יותר מאשר כאשר התיוג נעשה באמצעות צינורות פוליפרופילן תחתון חרוטים (איורים 3, 4 ו תוצאות לא פורסמו). גיל וסוג הדגימה יכולים להשפיע גם על רוחב שיא גם כאשר נהלי מכתים אופטימיזציה משמשים. לדוגמה, קורות חיים לימפוציטים PKH26 pos בודדו ממגוון נמשך טרי דם 14-20% (3 איור, Ref. 13 ותוצאות שלא פורסמו), ואילו קורות חיים ללימפוציטים שבודדו מ24 דגימות דם או ישנות hr טווח מסנני pheresis TRIMA 25-30 % (איור 4 ומס. 18).
הכתמת אחידות והמידה שבה ניתן לשלול תאים שאינם בנות קיימא מהניתוח ששניהם משפיעים אם פסגות בת הבחנה, אינן ניכרו בפרופיל דילול הצבע, אשר בתורו משפיע על בחירה של מודל התפשטות כדי להתאים את הנתונים שנצפו (איורים 5, 6 </strong>). למרות ModFit (ריטי בית תוכנה, Topsham, ME) משמש כאן כדוגמה לתוכנה המשמשת ליצירת מדדים כגון מדד פרוליפרציה ותדר מבשרו (איורי 3, 5 ו 6; לוח 3), חבילות תוכנה אחרות מכילות גם מודולים לניתוח נתוני תפוצה. כולל FCSExpress אלה (דה נובו תוכנה, לוס אנג'לס, קליפורניה) וFlowJo (עץ כוכבים, Inc, אשלנד, או). כל התוכניות הללו להשתמש בניתוח ריבועים לפחות לא ליניארי ערוך את למצוא את ההתאמה הטובה ביותר לנתונים הגולמיים על ידי שינוי המיקום, הגובה וSD (או רוחב) של פסגות גאוסיים מייצגות דורי בת רציפות. מדד שגשוג (PI) ותדר מבשרו (PF) הם האמצעים הנפוצים ביותר של היקף ההתפשטות. PI, כפי שהוגדר על ידי ModFit, הוא מדד לעלייה במספר תאים במהלך הבדיקה, המקביל "אינדקס הגירוי" של assay ספיגת תימידין. PF מחזיר את החלק היחסי של תאים בpopulat הראשונייון שהגיב לגירוי בהצלחה רבה. זהירות מומלצת, עם זאת, בעת קריאת הספרות מאז הטרמינולוגיה משתנית במקצת בין חבילות תוכנה (לדוגמה, FlowJo וModFit להשתמש בהגדרות וחישובים שונים למה הכוונה ב "הפצת המדד") 22.
הנושאים הקריטיים דנו כאן על תיוג וניתוח התפשטות עם צבעי קרום גם הם נתקלו בעת שימוש בצבעי חלבון. לדוגמה, תשומת לב קפדנית לטכניקת ערבוב חייבת להיות גם שנצפתה, יחד עם הרחקה של תאים מתים / גוסס, על מנת לקבל הפצות אחידות ופסגות בת נבדלות בעת שימוש CFSE (איור 6) 2-4,13,18,24. בחירה המתאימה של fluorochromes לphenotyping והערכת כדאיות היא חשובה גם כדי להימנע מחפיפת רפאים מוגזמות וחוסר יכולת לזהות תאי נוגדנים חיוביים, במיוחד עם צבעי חלבון פולט גלויים כגון CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup>. הקטנת הריכוז של צבע מעקב מפחיתה בעיות פיצוי בערוצי רפאים סמוכים, אך גם מגבילה את מספר חלוקות תא הניתן לפיקוח לפני עוצמות תא בת להתחיל חפיפה עם autofluorescence. לחלופין, השתמש בצבעי מעקב סלולרי חדשים יותר כגון קלרט אדום רחוק הפולט CellVue (סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) או פולט סגול CellTrace יולט (טכנולוגיות חיים, גרנד איילנד, ניו יורק) עשוי להפחית את בעיות פיצויים (איור 6). לבסוף, למרות שצבעי קרום בדרך כלל נוטים להפגין פחות רעיל 11,26, ניתן לתאים מעל תווית עם או כיתה של צבע. לכן, תמיד יש צורך לוודא שהריכוז של צבע מעקב בשימוש לא שינה את הפונקציונליות של התאים להיות במעקב (איור 6) 3,13,16,18.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הכותבים במיוחד ברצוני להודות לאנשים הבאים לתרומות הטכניות ואינטלקטואליות שלהם לפיתוח השיטות האלה במהלך השנים: ברוס Bagwell (ריטי בית תוכנה), דורוס ברקוביץ (IDM), ליזאן רסלין (Zynaxis הסלולרי מדע ומחקר PTI) , בריאן גריי (PTI מחקר), יאן פישר (Dartmouth ספר לרפואה), אליס Givan (Dartmouth ספר לרפואה), בטסי אוהלסון וילהלם (SciGro, Inc), ומרי וו (Dartmouth ספר לרפואה). הם גם רוצים להודות לבודווין הכיתה של 2006 מהקורסים השנתיים בשיטות מחקר והשימושים של cytometry זרימה, שהניבו את הנתונים שמוצגים באיור 2.
cytometry הזרימה בוצע במעבדתו של Roswell Park Cancer Institute תזרים Cytometry, שהוקמה בחלקו על ידי מענקי ציוד מהתכנית המשותפת Instrument-NIH, ומקבל תמיכה מליבת גרנט (5 P30 CA016056-29) מהלאומיסרטן המכון לRoswell Park Cancer Institute, ובמרכז הסרטן Cytometry אברמסון הזרימה ומשאבי המעבדה ניידת מיון של אוניברסיטת פנסילבניה, שהוקמה בחלקו על ידי מענקי ציוד מתכנית הכלי המשותף NIH, ומקבל תמיכה מNIH # 2P30 CA016520 מהמכון הלאומי לסרטן. העבודה מוצגת באיורי 3 ו 5 הייתה גם נתמכת בחלקו על ידי מענק SBIR EB00228 מהמכונים הלאומיים לדימות וBioengineering יו (NIBIB) הוענקו לPTI Research, Inc
Materials
| Reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Commercially Purchased | |||
| 7-Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-079 | Calcium and magnesium free, without phenol red |
| Human IgG Cohn fraction II and III globulins | Sigma-Aldrich | G-4386 | |
| Mouse anti-human CD3-FITC | BD Biosciences | 349201 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
| Mouse anti-human CD4-APC | BD Biosciences | 340672 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
| Mouse anti-human CD4-PECy7 | BD Biosciences | 348799 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
| Mouse anti-human CD8-FITC | BD Biosciences | 347313 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
| Mouse anti-human CD8-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD0805 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
| Mouse anti-human CD19-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD1905 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
| Mouse anti-human CD25-APC | BD Biosciences | 340938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
| Mouse anti-human CD127-PE | BD Biosciences | 557938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
| Mouse anti-human CD3 | eBiosciences | 16-0037-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
| Mouse anti-human CD28 | eBiosciences | 16-0289-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
| PBS | Gibco | 21300-058 | |
| PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT or MINI26-1KT |
Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes |
| CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) | Invitrogen (Life Technologies) | C34554 | Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) |
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Invitrogen (Life Technologies) | L34955 | |
| Sterile 12 x 75 mm conical polypropylene tubes & caps |
VWR | 60818-102 | Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration) |
| 12 x 75 mm round bottom polystyrene tubes |
Becton Dickinson | 21008-936 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur LSRFortessa |
Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | LSRII CyAn | Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
| Laboratory Prepared | |||
| 7-Aminoactinomycin D, concentrated stock |
NA | NA | 1 mg/ml in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C. |
| 7-Aminoactinomycin D, working stock |
NA | NA | 100 μg/ml in PBS; prepare daily from 1 mg/ml frozen stock. |
| IgG block | NA | NA | HBSS + 10 mg/ml Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/ml BSA. |
References
- Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).
- Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications. Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).
- Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O’Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques. J. Immunol. 184, 303-314 (2010).
- Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties. Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).
- Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy. Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).
- Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -. J. Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells. Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).
- Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen. J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).
- Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells. Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).
- Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF). Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).
- Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation. Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).
- Givan, A. L. A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation. Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).
- Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation. Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).
- Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution. Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).
- Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry. Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).
- Fuse, S., Underwood, E. Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry. Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).
- Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 111, 3546-3552 (2008).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).
- Roederer, M. Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian. Cytometry. 79A, 95-101 (2011).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).
- Houlihan, D. D., Newsome, P. N. Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease. Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).
- Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory. T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).
Tags
Optimized StainingProliferation ModelingCell Division MonitoringCell Tracking DyesFlow CytometryImage CytometryStem CellsProgenitor CellsMembrane TransferPrecursor Cell ProliferationImmune Regulatory CellsEffector Cell FunctionCommercially Available DyesMembrane DyesProtein DyesMulticolor StudiesOptimal Use Of Dyes
Cite This Article
Tario Jr., J. D., Humphrey, K., Bantly, A. D., Muirhead, K. A., Moore, J. S., Wallace, P. K. Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287, doi:10.3791/4287 (2012).