Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Membrane Farbstoffe wie PKH26 durch nahezu sofortige Aufteilung Flecken in Zellmembranen anstatt durch chemische Reaktion (CFSE) oder Gleichgewichts-Bindung (für Antikörper). Mangelnde Aufmerksamkeit auf die kritischen Fragen in Abbildung 1 dargestellt kann bei schwachem oder heterogene Färbung der in Abbildung 2 dargestellt führen. Im Gegensatz dazu optimierte Kennzeichnung Bedingungen zu nutzen (Abbildung 1, Tabelle 2) Ergebnisse in hellen homogenen Verteilungen geeignet für eine Vielzahl von Zell-Tracking-Anwendungen einschließlich der Zellteilung Überwachung auf Farbstoffdilution (Abbildung 3). Dead / absterbenden Zellen verlieren unterschiedliche Mengen von Tracking-Farbstoff, der zu erweitern und / oder neigen Tochter Generation Intensitäten und erschweren Verbreitung Modellierung auf Farbstoffdilution 3,4,16,18 basiert. Verwendung eines Lebensfähigkeit Farbstoff wird daher empfohlen, bei der Erhebung Farbstoffdilution Daten unter Bedingungen, bei denen eine erhebliche Zahl von toten Zellen vorbehandelt werden kanngesendet, wie stimulierten Kulturen (Figur 3) oder ältere Proben (Abb. 4). Weil Tracking Farbstoff Kennzeichnung gibt typischerweise Fluoreszenzintensitäten mehrere Größenordnungen größer als Immunphänotypisierung, ist es wichtig, geeignete Kompensation Kontrollen (Tabelle 1) aufzunehmen und zu überprüfen, dass die Anwesenheit von Tracking Farbstoff nicht beeinträchtigen Fähigkeit, Antikörper positiven und negativen Zellen (beheben 4). Um die Notwendigkeit für übermäßige Farbkompensation vermeiden, ist es vorzuziehen, einen hellen Fluorochrom, oder nicht vorhanden auf Zellen von Interesse, wie ein Farbstoff von lebenden Zellen ausgeschlossen sind, in der spektralen Kanal (die) an der Tracking-Farbstoff platzieren (Abbildung 4A & B vs. 4C & D). Bei Verwendung Peak Modellierungssoftware um Ausmaß der Proliferation zu quantifizieren, um eine gute Passform erfordert übereinstimmenden Annahmen, die im Modell der Eigenschaften des Farbstoffes Verdünnung profiles analysiert (Abbildung 5 und Tabelle 3). Bei entsprechender Auswahl der Farbstoffe und Tracking Lebensfähigkeit Reagenzien, ist es auch möglich, proliferativen Reaktionen in mehreren Lymphozytensubpopulationen gleichzeitig zu charakterisieren. Zum Beispiel, wie in 6 dargestellt, vereinfacht Zugabe eines zweiten Markierungsfarbstoff Diskriminierung zwischen regulatorischen T-Zellen (markiert mit CellVue Claret) und stark proliferierten Effektor-T-Zellen (markiert mit CFSE) und bietet viel ausführlicher über ihre Interaktionen als dies erhalten werden mit 3 H-Thymidin Etikettierung 18,27. Abbildung 1. Allgemeine Membran Kennzeichnung Protokoll für PKH26, PKH67 und CellVue Farbstoffe. Partitionierung dieser hoch lipophile Farbstoffe in die Zelle membranes erfolgt im wesentlichen sofort nach dem Mischen mit Zellen, wenn Färbung erfolgt in der salzfreien Diluent C Fahrzeug zur Farbstofflöslichkeit und Färbung Effizienz zu maximieren. Wie in dieser schematischen für allgemeine Membran Kennzeichnung zusammengefaßt mit PKH26, ist hell, gleichmäßige und reproduzierbare Färbung daher am einfachsten erhalten: 1) Minimieren der Mengen an Protein und / oder Salze, die in den Färbeschritt und 2) unter Verwendung eines Misch-Technik, stellt sicher rasche homogene Verteilung von Zellen in Farbstoff (dh gleichzeitig macht alle Zellen auf die gleiche Konzentration an Farbstoff). Abbildung 2. Wirkung der Färbung Bedingungen PKH26 Fluoreszenz-Distributionen (aus Lit. 18).. Parallelproben von logarithmisch wachsenden, kultiviert UFür 3 min bei Umgebungstemperatur mit oder ohne sofortige Vermischung auf Zusatz von 2x Zellen Farbstoff 2x -: 937 Zellen wurden mit PKH26 (15 uM PKH26 1 x 10 7 Zellen / ml, 12 Endkonzentrationen) angefärbt. Nach dem Waschen wurden gefärbten Zellen auf einem Beckman Coulter CyAn Durchflusszytometer mit konstanter Geräteeinstellungen analysiert Histogramm 1:. Ungefärbte Kontrolle mit PKH26 Detektorspannung eingestellt, um alle Zellen auf der Skala in der ersten Dekade stellen mit wenigen / keine Zellen, der sich in den ersten Kanal. Histogramm 2: Färbung bei 15 uM Farbstoff durch Addition von 2x Zellen Farbstoff mit sofortiger Mischen 2x ergab eine helle, homogen gefärbten, symmetrische Population von Zellen in der vierten Dekade platziert, wobei wenige / keine Zellen der sich in den letzten Kanal (= gMFI . 2548, GCV = 26,2%) Histogramm 3: Färbung bei 15 uM Farbstoff mittels Zugabe von Zellen 2x 2x Farbstoff aber ohne unmittelbare Durchmischung zu einer verminderten Intensität und eine breitere CV (gMFI = 505 , GCV = 116%) sowie eine dunkel gefärbte Subpopulation, möglicherweise aufgrund eines Abfalls der Zellen auf der Wand des Rohres statt in die 2x Farbstofflösung verzichtet Histogramm 4:. Eine Färbung Fehler führte zu 3 ul konzentrierter Farbstoff ethanolischer Lager direkt an Zellen in Diluent C ohne weiteres Mischen anstatt verwendet, um eine Farbstofflösung in 2x Diluent C. Diese in einem abschließenden Farbstoffkonzentration von 12 uM Folge vorzubereiten 2x zugegeben sondern gab extrem schwach und heterogene Färbung (gMFI = 32,9, GCV = 1020%). Die beobachtete richtigen Skew wahrscheinlich die kombinierten Effekte von widerspiegelt: i) schlechte Vermischung aufgrund weit auseinander Zelle und Farbstoff Bände, und ii) die Tatsache, dass die Zellen am nächsten an den Farbstoff Entnahmestelle zu einer höheren Konzentration des Farbstoffs wären als diejenigen weiter ausgesetzt werden entfernt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen . re 3 "src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg "fo: content-width =" 4.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/> Abbildung 3. Verwendung einer Sonde Lebensfähigkeit vereinfacht Gating der T-Zellproliferation Profilen hPBMC mit PKH26 (Endzellkonzentration: 3×10 7 / ml; endgültige Farbstoffkonzentration: 10 uM) markiert wurden.. Nach der Kultur für 96 Stunden in Gegenwart (stimuliert) oder Abwesenheit (unstimulierten) von Anti-CD3 und IL-2 wurden die Zellen mit anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC und 7-AAD gegengefärbt und wurden für ein analysiert FACSCalibur Durchflusszytometer (siehe Referenz 13 für Details). Farbkompensation wurde zum Zeitpunkt der Datenerfassung mit festverdrahteten Kompensationsschaltungsanordnung durchgeführt. Das Ausmaß der Proliferation wurde modelliert, wie in Schritt 4 beschrieben mit der Proliferation Assistenten in ModFit LT3.3. Daten aus dem PKH26 neg Kontrolle (Tabelle 1, Tube 7) werden als Referenz (grau ausgefüllt Histogramme in Spalte 3) überlagert. Bewohnbarkeit für unstimulierten und stiformulierten Kulturen waren 76% und 62% (ungated Daten für Felder A und B, jeweils). Systemsteuerung A. PKH26 gefärbten Zellen für 96 h in Medium kultiviert wurden gated um lebensfähige (7-AAD neg) CD3 pos Zellen (R1) umfassen. Zusätzlich zu dem Antikörper Eingliederung und 7-AAD toten Zellausschlussschicht Gate, einer Vorwärtsstreuung (FSC) versus Seitenstreuung (SSC) Gate (R2) wurde verwendet, um Debris und Aggregate auszuschließen. Beachten Sie das Fehlen von toten Zellen in der letzten Grundstück in diesem Panel. Die beste Anpassung Modell für die Proliferation PKH26 Profil (Spalte 3) ergab einen einzigen Peak mit RCS = 2,1 (Donor 6, Tabelle 3), was auf eine gute Symmetrie, und wurde verwendet, um die Position zu definieren elterlichen und Starten Peakbreite zur Analyse des stimulierten Probe aus diesem Datensatz (Panel B). Feld B. Ein Replikat Aliquot PKH26 gefärbten Zellen wurde mit Anti-CD3 und IL-2 für 96 Std. und gated in gleicher Weise kultiviert wie im Feld A. ein Modell mit schwimmenden Peakposition und variabel Peakbreite gab die beste Anpassung für diese Daten mit RCS = 1,3 (Donor 6, Tabelle 3). Systemsteuerung C. Das gleiche Datendatei wie in Tafel A ohne Verwendung von 7-AAD-Daten analysiert. Wenn ein primärer FSC vs SSC wurde verwendet, um teilweise auszuschließen toten Zellen und Zuschlagstoffen (R2) und einen sekundären Gate mit CD3 positive Ereignisse (R3) auszuwählen, blieb ein kleiner Rest-Population von toten Zellen (0,2% Gated Ereignisse). Die beste Anpassung Modell ergab eine einzelne Spitze mit RCS = 2,2. Systemsteuerung D. Das gleiche Datendatei als in Panel B gated war wie in Panel C Beachten Sie die größere restliche Bevölkerung von toten Zellen im stimulierten Probe (1,29% der gated events) für dieses Gating Strategie. Die beste Anpassung Modell war ein mit schwimmenden Spitzenposition und variabel Peakbreite (RCS = 1,3). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen . ig4.jpg "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/> Abbildung 4. Wirkung von Fluorochrom Wahl und Farbstoffkonzentration auf die Fähigkeit zur Immunphänotyp Lymphozyten mit PKH26 beschriftet. HPBMC wurden aus 24-Stunden altes Blut isoliert und mit PKH26 wie in Schritt 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass Färbung erfolgte in 12 x 75 mm mit rundem Boden durchgeführt Polystyrolröhrchen anstatt 12 x 75 mm konische Polypropylen-Röhrchen. Unmittelbar nach der Markierung mit PKH26 wurden die Zellen mit den angegebenen immunphänotypische und Lebensfähigkeit Reagenzien gegengefärbt und analysiert auf einem LSRFortessa Durchflusszytometer unter Verwendung der Strategie der Gating 3A und die folgende optische Konfiguration: 488 nm-Laser: FSC-A (488 nm); SSC -A (488/10 BP), FITC-A (530/30 BP); PKH26-A (575/26 BP); 7-AAD-A oder PerCP-A (695/40 BP). 640-nm-Laser: APC-A oder TOPRO-3-A (670/14 BP). Farbkompensation wurde zum Zeitpunkt der Datenerfassung mittels BD DiVa Software durchgeführt. "Auto"zeigt Autofluoreszenz des no-Antikörper Kontrolle im relevanten spektralen Fenster (APC für Platten A und B, PerCP für Panels C und D). Daten aus dem PKH26 neg Kontrolle (Tabelle 1, Tube 7) werden als Referenz (grau ausgefüllt Histogramme, Spalte 5) überlagert. Post-Färbung Bewohnbarkeit waren ähnlich für alle Proben (88-92%). Feld A. Zellen mit PKH26 in einer Endkonzentration von 2 uM markiert wurden gegengefärbt Verwendung von anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, und 7-AAD ( Rohr 8 von Tabelle 3). Nach Gating auf lebensfähigen (7-AAD neg) CD3 pos Lymphozyten (Spalte 1) und den Ausschluss von Schutt und Aggregate auf FSC und SSC (siehe 3A) basiert, wurde PKH26 Intensität in Kombination mit APC CD4 (Spalten 2 und 3) ausgewertet. Ob unkompensierte (Spalte 2) oder kompensiert (Spalte 3), führte dies Fluorochrom Kombination in guter Auflösung zwischen CD4 pos T-Zellen und CD4 neg T-Zellen), als beide von einem no-a überprüftntibody, autofluoreszierenden Kontrolle (Tube 6 der Tabelle 1; Spalte 4) und die zweifarbige Darstellung der CD3 vs. CD4 (Spalte 6). Tafel B. Unter Verwendung des gleichen Fluorochrom-Kombination nach Panel A, aber die Erhöhung der endgültigen Konzentration PKH26 bis 4 uM beeinträchtigte nicht die Fähigkeit, CD4 T-Zellen aus pos CD4 T-Zellen neg. lösen. Systemsteuerung C. Replikat Aliquot von Zellen unabhängig mit PKH26 in einer Endkonzentration von 2 uM markiert war gegengefärbt Verwendung von Anti-CD3-FITC, anti-CD4-PerCP und TOPRO-3. Nach Gating auf lebensfähigen (TOPRO-3 neg) CD3 pos Lymphozyten (Spalte 1) und den Ausschluss von Schutt und Aggregate auf FSC und SSC (siehe 3A) basiert, wurde PKH26 Intensität in Kombination mit anti-CD4-PerCP (Spalten 2 und ausgewertet 3). Substanzieller spektraler Überlappung PKH26 in die PerCP-Kanal zeigt sich in den unkompensierten Daten (Spalte 2), Auflösung zwischen PKH26 pos CD4 <sup> pos und PKH26 pos CD4 neg Veranstaltungen ist marginal nach Kompensation angewendet wird (vgl. Spalte 3 mit dem no-Antikörper, autofluoreszierenden Kontrolle in Spalte 4 dargestellt). Systemsteuerung D. Wenn PKH26 Konzentration auf 4 uM erhöht wird, ist es nicht mehr möglich die Kombination von Fluorochrom Systemsteuerung C Spektrale Überlappung von PKH26 in die PerCP-Kanal verwenden übersteigt die Intensität des Signals von CD4 (Spalte 2) und CD4 pos PKH26 pos Ereignisse nicht mehr von CD4 gelöst werden neg. PKH26 pos T-Zellen (Spalte 3 vs. Spalte 4). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen . Abbildung 5. Effect der Proliferation Modell Auswahl auf. goodness of fit für Farbstoffdilution Profile hPBMC wurden mit PKH26 (:; endgültigen Farbstoffkonzentration 3×10 7 / ml: 10 uM Endzellkonzentration) markiert. Nach der Kultur für 96 Stunden in Gegenwart (stimuliert) oder Abwesenheit (unstimulierten) von Anti-CD3 und IL-2 wurden die Zellen geerntet gegengefärbt mit anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC und 7-AAD und auf einer analysierten FACSCalibur Durchflusszytometer (siehe Referenz 13 für detaillierte Methoden). Farbkompensation wurde zum Zeitpunkt der Datenerfassung mit festverdrahteten Kompensationsschaltungsanordnung durchgeführt. Panel A. Die PKH26 Intensitätsprofils aus einem 96-Stunden-Kultur unstimulierten für abgebende 5, eine moderate Responder war gated wie in 3A gezeigt, und verwendet, um die Proliferation bereitzustellen ModFit Assistenten mit einer ersten Schätzung der Position und Breite für den Peak repräsentieren ungeteilten parentalen Zellen. Tafel B. Die PKH26 Intensitätsprofils aus einem parallelen stimuliert 96 Stunden Kultur wurde unter Verwendung der Ausgangsstoffe SchätzungenPanel A und 4 verschiedene Kombinationen von "Proliferation Wizard 'Einstellungen, entsprechend fest-oder variabel Peakintensitäten und fest-oder variabel Peakbreiten für aufeinanderfolgende Tochter Generationen gezeigt. Wie in Tabelle 3, das Modell, das die beste Anpassung an die beobachteten Daten ergab zusammengefasst (niedrigste reduzierte Chi-Quadrat; RCS) war das "Floating / Floating"-Kombination, in denen nicht nur Peak-Positionen, sondern auch Standardabweichungen der Tochter Generation Peaks wurden zugelassen zu variieren (RCS = 1,5). Das gleiche Modell hat die beste Passform für Donor 6 ist eine hohe Responder (3B und Tabelle 3). Abbildung 6. Zugabe einer zweiten Zelle Markierungsfarbstoff vereinfacht Diskriminierung zwischen Effektorzellen und regulatorische T-Zellen in einer flusszytometrischen Assay Unterdrückung(Aus Lit. 18). Monozyten-Lymphozyten aus abgereichertem TRIMA Leukapherese Filter hergestellt mit anti-CD127-PE, anti-CD4-PE-Cy7 gefärbt wurden, und Anti-CD25-APC und fließen in Populationen von Effektorzellen (Teff sortiert.; CD4 pos CD127 hellen CD25 dim), regulatorische (Treg; CD4 pos CD127 dim CD25 pos) und Zubehör (CD4 neg) Zellen. Sortiert Treg-Zellen mit CellVue Claret (Endzellkonzentration: 1×10 6 / ml; endgültigen Farbstoffkonzentration: 1 uM) beschriftet und sortiert Teff mit CFSE (Endzellkonzentration: 5 × 10 7 / ml; endgültigen Farbstoffkonzentration, 5 uM) markiert waren in unterschiedlichen Verhältnissen in Gegenwart von Anti-CD3, Anti-CD28 und bestrahlten akzessorischen Zellen co-kultiviert. Nach 96 Stunden wurden die Kulturen geerntet, gegengefärbt mit anti-CD4-PE-Cy7 und LIVE / DEAD Fixierbarer Violet, und analysiert auf einem LSRII Durchflusszytometer und Farbkompensation wurde zum Zeitpunkt von Daten durchgeführt AKQUISITIOn mit BD DiVa Software (siehe Referenz 18 für Einzelheiten einschließlich der Vergütung Kontrollen). Die Proliferation Indizes für Teff und Treg wurden modelliert, wie in Schritt 4 beschrieben, mit der Proliferation Assistenten in ModFit LT3.3. Datenpunkte in Abbildung B und C stellen den Mittelwert ± 1 Standardabweichung von dreifachen Proben Feld A. Repräsentative Daten sind für eine von drei Proben bei einer dreifach Treg gezeigt:. Teff Verhältnis von 0,25:1. LIVE / DEAD Fixierbarer Violet Reagenz wurde verwendet, um abgestorbene Zellen (R1, oben links Grundstück; akzessorischen Zellen = rot-braun, lebensfähig Teff = grau und lebensfähig Treg = rot) ausgeschlossen von allen anderen Diagrammen. CellVue Claret Färbung wurde verwendet, um tragfähige Treg (R4, Mitte rechts Grundstück; blau) zu unterscheiden von lebensfähigen, aber sehr vermehrt Teff (R5, Mitte rechts Grundstück; grün). Ein einzelner Parameter CFSE Proliferation Profil Teff (Plot unten links) wurde durch Gating auf Zellen, die CFSE pos (R5), CD4 pos (R3), lebensfähigen (nicht R1) generiert wurden, und hatten Lymphozyten scatter Eigenschaften (R2). Ein einzelner Parameter CellVue Claret Proliferation Profil Treg wurde durch Gating auf Zellen, die CellVue Claret pos (R4), CD4 pos (R3), lebensfähigen (nicht R1) generiert wurden, und hatten Lymphozyten Streueigenschaften (R2). Beachten Sie die großzügige Lymphozytenregion (R2) definiert Lymphozyten Blasten enthalten. Man beachte auch, dass Gesamtanzahl von Zellen gesammelt werden, auf der niedrigsten Frequenz Population von Interesse abhängen. In einer Zellproliferation Experiment, bei dem die Bevölkerung von Interesse über einen weiten Bereich von Intensitäten repräsentieren bis zu sieben oder acht Generationen eine große Anzahl von Zellen verteilt werden können, sollten gesammelt werden, um genau zu modellieren und berechnen die Anzahl der Zellen in jeder Generation werden. Bei der Untersuchung von seltenen Zellen, kann es notwendig sein, einfach das Probenröhrchen fast trocken, um die maximal mögliche Anzahl der Ereignisse zu sammeln. Für die hier gezeigten Beispiel, tun dies führte zu einer insgesamt ~ 25.000 Veranstaltungen, von denen 11.923 waren Teff (Proliferation Index 3,85) und 1380 waren Treg (Proliferationsindex 1,83). Feld B. Wie erwartet, Erhöhung des Anteils der Tregs in Co-Kulturen führte zu größeren Unterdrückung von Teff Zellproliferation. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den beiden CellVue Claret gebeiztes (durchgezogene Linie) oder ungefärbt (gestrichelte Linie) Treg erhalten, was anzeigt, dass die Färbung mit dem Farbstoff CellVue Claret Tracking beeinflusste nicht Treg Potenz. Systemsteuerung C Treg sind relativ anergischen und, wie erwartet, tat nicht proliferieren, wenn sie mit Anti-CD3, Anti-CD28, und akzessorischen Zellen in Abwesenheit von Teff Zellen (Treg: Teff Verhältnis von 1:0) inkubiert. Wie jedoch der Anteil der Teff in Co-Kulturen erhöht (dh als Treg: Teff Verhältnis erniedrigt), das Ausmaß der Proliferation Treg ebenfalls erhöht. Die allgemein größer Fehlerbalken für diese Daten zumindest teilweise durch die begrenzte Ausdehnung der Proliferation, was zu einer kleineren Anzahl von Ereignissen gesammelt relativ zu Teff und größer unsicherty bei der Modellierung der Anzahl der Zellen in jeder Generation. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen . Rohrnummer (Zweck) PKH26 Antikörper (n) 7-AAD 1 (Setup, Schadensersatz) – – – 2 (Setup, Kompensation) + – – 3 (Setup, Kompensation) – – + 4 (Kompensation) – CD8-FITC b – 5 (Kompensation) – CD8-APC b – 6 (kein Ab-Steuerung) + – + 7 (keine Tracking-Farbstoff control) – CD3-FITC CD4-APC-oder CD19-APC c + 8 (T0 Kontrolle) + CD3-FITC CD4-APC-oder CD19-APC c + . Tabelle 1 Instrument Setup Steuert a a aufgeführten Bedienungsvorgänge sind für eine 4-Farb-CD4 T-Zellproliferation Überwachung Assay mit:. PKH26 (Proliferation Farbstoff), CD3-FITC (pan-T-Zell-Marker), CD4-APC (T-Helfer- Zellmarker), 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, tote Zellausschlussschicht) b Brighter Surrogate für CD3-FITC und CD4-APC (bessere Fähigkeit zur Kompensation Fehler zu erkennen) c. Abbildung 3:. CD3-FITC und CD19-APC. d Abbildung 4: CD3-FITC und CD4-APC. Zelltyp Endzellkonzentration Finale Dye Konzentration </ Strong> Referenz hPBMC b 1 x 10 7 / ml 2 uM PKH67 10,17 5 x 10 6 / ml 2 uM PKH26 12 3 x 10 7 / ml 10 uM PKH26 13 5 x 10 7 / ml 30 uM PKH26 18 1 x 10 6 / ml 1 uM CellVue Claret c 18 3 x 10 7 / ml 4 uM CellVue Claret 13 5 x 10 7 / ml 5 uM CellVue Claret 18 Zellen in Kultur 5 x 10 5 / ml 0,1 uM PKH26 (1 ° Milchdrüsenzellen) 8 1 x 10 7 / ml 15 uM PKH26 (U937) 18 1 x 10 7 / ml 12,5 -15 uM PKH26 (U937) 15 1 x 10 7 / ml 1 uM PKH67 (K562) 18 1 x 10 7 / ml 1 uM PKH67 (T-Zell-Linien) 9 1 x 10 7 / ml 10 uM CellVue Claret (YAC-1) 23 Tabelle 2. Nicht-Stören Membran-Dye Färbung Bedingungen a. A Angepasst und aktualisiert Ref. 18. B A niedriger Geschwindigkeit Waschung (300 × g) wurde verwendet, um Blutplättchen Kontamination zu minimieren. C Treg-Zellen (Flow sortiert CD4 pos CD25 pos CD127 neg. Lymphozyten). Modell Settings <td colspan = "6"> Model Ergebnisse Spender Behandlung Peak Position SD Parental Position Parental SD Anzahl der Peaks Ausgestattet RCS PI PF 5 Unstimulierten Schweben Schweben 209 4,5 1 5,1 1,0 0 5 Angeregt Behoben Behoben 209 <td> 4,5 7 35 3,9 31 5 Angeregt Schweben Behoben 209 4,5 8 19 4,3 30 5 Angeregt Behoben Schweben 209 9,2 6 1,9 3,8 30 5 Angeregt Schweben Schweben 209 9,0 7 1,5 3,7 29 6 Unstimulierten Schweben Schweben 205 4,0 1 2,1 1,0 0 6 Angeregt Behoben Behoben 205 4,0 6 42 6,6 60 6 </ Td> Angeregt Schweben Behoben 205 4,0 7 12 7,4 60 6 Angeregt Behoben Schweben 205 8,6 6 6,9 6,8 62 6 Angeregt Schweben Schweben 205 6,5 6 1,3 6,5 59 Tabelle 3. Auswirkungen der Proliferation Modell auf Goodness of Fit (RCS) und Proliferation Metrics ein. Ein Sample Färbung, Datenerfassung und Gating wie in 3A & B beschrieben.