JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Published: December 13, 2012
doi:
10.3791/4287
, , , , ,
1Department of Flow and Image Cytometry,Roswell Park Cancer Institute, 2Flow Cytometry & Cell Sorting Resource Laboratory,University of Pennsylvania , 3SciGro, Inc., 4Department of Pathology and Laboratory Medicine,University of Pennsylvania

Summary

Succesvol gebruik van cell tracking kleurstoffen aan immuun cel functie en proliferatie monitoren omvat verschillende kritische stappen. We beschrijven werkwijzen voor: 1) het verkrijgen helder, uniform en reproduceerbaar label-ing met membraan kleurstoffen, 2) het selecteren fluorochromen en data acquisitie niet, en 3) het kiezen van een model gebaseerd op celproliferatie kleurstof verdunning kwantificeren.

Abstract

Fluorescente kleurstoffen cell tracking in combinatie met vloeien en beeldcytometrie, zijn krachtige instrumenten om de interacties en lot van verschillende celtypen in vitro en in vivo te bestuderen. 1-5 Hoewel er letterlijk duizenden publicaties met dergelijke kleurstoffen, sommige de meest voorkomende cell tracking toepassingen zijn onder meer de controle van:

  1. stam en progenitor cel rust, proliferatie en / of differentiatie 6 tot 8
  2. antigen-driven membraan overdracht 9 en / of precursor celproliferatie en 3,4,10-18
  3. immuun regulerende en effector cel functie 1,18-21.

In de handel verkrijgbare cell tracking kleurstoffen variëren sterk in hun chemie en fluorescentie eigenschappen, maar de grote meerderheid vallen in een van twee klassen op basis van hun mechanisme van de cel etikettering. "Membraan kleurstoffen", gekenmerkt door PKH26, zijn sterk lipofiele kleurstoffen thoed partitie stabiel, maar niet-covalent in celmembranen 1,2,11. "Protein kleurstoffen", gekenmerkt door CFSE, zijn amino-reactieve kleurstoffen die stabiele covalente bindingen vormen met celeiwitten 4,16,18. Elke klasse heeft zijn eigen voordelen en beperkingen. De sleutel tot een succesvolle verwerking, met name in veelkleurige studies waar meerdere kleurstoffen worden gebruikt om verschillende soorten cellen te volgen, is dan ook te begrijpen van de cruciale problemen waarmee optimaal gebruik van elke klasse 2-4,16,18,24.

De protocollen hier opgenomen wijzen op drie meest voorkomende oorzaken van een slechte of wisselende resultaten bij het gebruik van cel-tracking kleurstoffen. Deze zijn:

  1. Het niet heldere, uniforme, reproduceerbare etikettering te bereiken. Dit is een noodzakelijke startpunt voor een cell tracking studie, maar vereist aandacht voor verschillende variabelen bij het gebruik van membraan kleurstoffen dan bij het gebruik van eiwitten kleurstoffen of evenwicht bindende reagentia zoals antilichamen.
  2. Suboptimale fluorochroom combinaties eennd / of het niet in kritieke schadevergoeding controles omvatten. Tracking kleurstof fluorescentie is typisch 10 februari-10 maart keer helderder dan antilichaam fluorescentie. Het is daarom essentieel om te verifiëren dat de aanwezigheid van tracking kleurstof niet de mogelijkheid om andere probes worden gebruikt detecteren nemen.
  3. Het uitblijven van een goede fit met piek modeling software te verkrijgen. Dergelijke software maakt het mogelijk kwantitatieve vergelijking van proliferatieve reacties in verschillende populaties of stimuli op basis van precursorfrequentie of andere statistieken. Het verkrijgen van een goede pasvorm, vereist echter uitsluiting van dode / stervende cellen die kunnen vervormen kleurstof verdunning profielen en afstemming van de uitgangspunten van het model met de kenmerken van de waargenomen kleurstof verdunning profiel.

Hier gegeven voorbeelden laten zien hoe deze variabelen kunnen beïnvloeden resultaten bij gebruik membraan en / of eiwit kleurstoffen celproliferatie controleren.

Protocol

1. Algemene Membraan Labeling met PKH26 Mobiele Tracking Dye (Ref. 25; figuur 1) Steriele techniek stappen 1,1 tot 1,9. Bereid ~ 10 7 menselijke perifere mononucleaire bloedcellen of lymfocyten (hPBMC, hPBL) met de laboratorium standaardmethode onder toevoeging van een definitieve 300 g centrifugeren van de bloedplaatjes besmetting te minimaliseren. Resuspendeer cellen bij 10 7 / ml in HBSS +1% BSA en plaats op ijs, reserveren van een 500 pi aliquot (5×10 6 cellen) voor gebruik in stap 2. Place 5×10 6 cellen (500 ui) in een 12 x 75 mm conische polypropyleen buis. Was eenmaal met 3,5 ml HBSS. Zorgvuldig aspireren het supernatans, waardoor niet meer dan 15 tot 25 ul van de resterende vloeistof, maar zorg ervoor dat u cellen te verwijderen. Gebruik deze tube naar een 2x celsuspensie te bereiden in stap 1.4. Tijdens de cel wassen in Stap 1.2, voeg 0,5 ml van Diluent C labeling voertuig (de PKH26GL kit) een 12 x 75 mm conische polypropyleen buis. Gebruik deze tube naar prepeen 2x PKH26 oplossing in stap 1.5. Voeg 0,5 ml van Diluent C labeling voertuig aan de gewassen celpellet van Stap 1.2 en zuig en verdeel 3-4 keer aan een enkele celsuspensie (2x cellen) te verkrijgen. Vermijd schuimvorming en overmatige mengen, die levensvatbaarheid van de cellen en herstel kan verminderen. Onmiddellijk na bereiding van de 2x celsuspensie in Stap 1.4, stelt een 2x (4 uM) kleurstofoplossing door toevoeging van 2,0 ul 1,0 mM PKH26 kleurstof stock in ethanol (uit het PKH26GL kit) aan het oplosmiddel C buis geproduceerd in stap 1.3 en vortex te verspreiden gelijkmatig. Onmiddellijk na de voorbereiding van de 2x kleurstofoplossing in Stap 1.5, snel pipetteer de 2x celsuspensie van Stap 1.4 in de 2x kleurstof oplossing en tegelijkertijd aanzuigen en dispenseren 3-4 keer volledig cellen verspreiden in kleurstof Niet doen:. Direct toe te voegen 1,0 mM kleurstof cellen; pour 2x cellen in 2x kleurstof, of voeg 2x cellen kleurstof 2x terwijl vortexen. Omdat kleuring is bijna onmiddellijke, zoals methoden leveren minderuniform intensiteiten dan de aanbevolen methode (figuur 2). Na 1 min, voeg 1,0 ml van warmte geïnactiveerd serum of HBSS +5% BSA om kleurstof opname te stoppen in celmembranen. Niet voldoende eiwitten gebruiken risico van de vorming van aggregaten kleurstof, die kan pellet met cellen tijdens de wasstappen en onbedoelde kenmerken van andere cellen aanwezig in een experiment. Als medium met 10% hitte-geïnactiveerd serum (CM) of HBSS +1% BSA wordt gebruikt als stopreagens, voert kleuren in een 15 ml conische polypropyleenbuis en voeg ten minste 5,0 ml stopreagens adsorptie van verzekeren zonder rechtspersoonlijkheid kleurstof. Centrifugeer de gelabelde cellen gedurende 5 min @ ~ 400 x g. Zorgvuldig aspireren het supernatans zonder het verwijderen van cellen. Was tweemaal het pellet met 4 ml HBSS of CM +1% BSA, dispergeren de pellet ruim voor recentrifugation. Om overdracht van kleurstof geadsorbeerd op buiswanden minimaliseren en maximaliseren wasefficiëntie, breng de cellen een nieuwe polypropyleenbuis na fiRST resuspensie. Opmerking: voldoende gekleurde cellen zal een duidelijke roze tint in de pellet vertonen. Resuspendeer de pellet gewassen cel in 1.0 ml HBSS +1% BSA. Tel de cellen bepalen celherstel, en het volume tot een eindconcentratie van 10 7 / ml. Met een zorgvuldige aspiratie moet cel herstel ≥ 85%. Als cel herstel is <70%, de oorzaak voordat u verdergaat. Trek een 150 ul aliquot (1.5×10 6 cellen) en plaats op ijs voor gebruik in stap 2. 2. Voorbereiding van Instrument en Assay Setup Controls (tabel 1) 50 pi aliquot (5×10 5) van ongekleurde cellen van de celsuspensie opgeslagen in Stap 1.1 in vijf verschillende 1,8 ml Eppendorf buisjes: 1, 3, 4, 5 en 7. 50 pi aliquot (5×10 5) van PKH26 pos cellen uit stap 1.9 in elk van drie buizen: 2, 6 en 8. Voeg 10 ul IgG blok (100 ug / buis van IgG, zie tabel van reagentia) tot 1-8 Tubesen incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ° C). Voeg een verzadigende hoeveelheid van het antilichaam (en) aangegeven in Tabel 1 tot Tubes 4, 5, 7 en 8 en incubeer alle monsters (Tubes 1-8) gedurende 30 min bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht. Voeg 1,5 ml HBSS +1% BSA voor alle monsters, pelleteren van de cellen door centrifugeren (5 min bij 400 xg) en was eenmaal met 1,5 ml HBSS +1% BSA, met zorgvuldige streven naar cel te voorkomen. Resuspendeer elk monster in 500 pi HBSS +1% BSA. Eventueel voor monsters die worden geanalyseerd op cytometer, naar een 12 x 75 mm ronde bodem buis. Voeg 10 ul van 100 ug / ml 7-AAD dagelijkse werkvoorraad (zie tabel reagentia) voor buizen 3, 6, 7 en 8 zoals aangegeven in tabel 1. Incubeer op ijs gedurende 30 min voorafgaand aan gebruik in flowcytometer setup en kleuring verificatie (Stap 3). 3. Flowcytometer Setup en kleuring Verificatie Controleer of de stroom cytometer goed werkt, met behulp van het laboratorium procedures vastgesteld voor de dagelijkse kwaliteitscontrole. Controleer of signalen kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd in elke spectrale window te gebruiken en detector respons lineair evenredig met de intensiteit in het venster worden gebruikt voor proliferatie controle 14 signaal. Acquire FSC vs SSC-gegevens voor Tube 1 met behulp van lineaire weergave schalen. Stel elke detector amplificatie zodat de lymfocytenpopulatie valt in de linker kwadrant van het puntenplot, niet buiten de schaal in een van de parameters en wordt onderbroken door drempelwaardebepaling. Verzamel ungated FSC vs SSC gegevens voor alle monsters in de stappen 3,3 tot 3,7. Acquire gegevens voor Tube 1, met behulp van geen kleur compensatie en logaritmische weergave schalen voor alle 4 fluorescentie detectoren. Stel elke detector hoogspanning (HV) de autofluorescentie van ongekleurde lymfocyten plaatsen op schaal met weinig / geen cellen accumuleren in het eerste kanaal. Stel een analyse voor elke grens histogramovereenkomt met de helderste 2% van ongekleurde cellen. Met behulp van geen kleur compensatie en de HV instellingen gevestigd in de stappen 3.2 en 3.3, te verkrijgen gegevens voor Tube 2, het verzamelen van FSC, SSC en signalen in alle 4 fluorescentie detectoren. Voor de detector wordt gebruikt om PKH26 fluorescentie monitoren, controleren of alle PKH26 pos cellen verschijnen op schaal als een enkele symmetrische piek in de 3 e -4 e decennium, met weinig / geen cellen in het laatste kanaal. Als er meerdere pieken of vorm van de piek is scheef, herhaalt u stap 1 met aandacht voor minimalisering en mengtechniek (figuur 2) zout. Indien nodig, kleurstof concentratie. Met behulp van de instellingen gevestigd in Stap 3.3, verwerven van gegevens voor Tube 3, het verzamelen van FSC, SSC en signalen in alle 4 fluorescentie detectoren. Voor de detector wordt gebruikt om 7-AAD fluorescentie controleren, verifiëren dat 7-AAD pos cellen vallen boven de 2% grens vastgesteld in stap 3.3 (dat wil zeggen, dat niet-levensvatbare cellen goed worden opgelostvan levensvatbare 7-AAD neg cellen). Met behulp van de instellingen gevestigd in Stap 3.3, te verkrijgen gegevens voor Buis 4, het verzamelen van FSC, SSC en signalen in alle 4 fluorescentie detectoren. Controleer of CD8 pos cellen goed worden opgelost uit ongekleurde cellen (dat wil zeggen, vallen boven de 2% grens vastgesteld in stap 3.3 voor de FITC detector). Herhaal dit met Tube 5 en controleer of CD8 pos cellen goed worden opgelost uit ongekleurde cellen (dwz val boven de 2% grens vastgesteld in stap 3.3 voor de APC-detector). Met instellingen vastgesteld in stap 3,3 verwerven gegevens voor buizen 6, 7 en 8, verzamelen FSC, SSC en signalen in alle vier fluorescentiedetectoren. Gebruik de lijstmodus bestanden verzameld Tubes 1-5 en een kleurcompensatie software om een ​​kleur vast overlappen matrix voor elk fluorochroom in de detectoren worden toegepast om de drie andere fluorochromen controleren. Breng deze matrix om de lijst-modus bestand voor Sample 6 en controleer of de aanwezigheid van PKH26 labeling verandert niets aan de mogelijkheid om 7-AAD pos cellen te detecteren. Breng de kleur overlappen matrix van stap 3,8 tot de lijst-modus bestand voor monster 7 en controleer of: a) 3 en opgelost subpopulaties (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg en CD3 pos CD4 pos) kunnen worden geïdentificeerd op een FITC vs APC puntdiagram en b) de aanwezigheid van anti-CD3-FITC en anti-CD4-APC neemt niet weg mogelijkheid 7-AAD pos cellen te detecteren. Indien de aanwezigheid van anti-CD3-FITC verandert de bovenste 2% grens voor de gegevens op de detector PKH26, past de grens als vereist. Breng de kleur overlap matrix van stap 3,8 tot de lijst-modus bestand voor Monster 8. Indien de aanwezigheid van PKH26 etikettering verandert de 2% grens voor de FITC, 7-AAD of APC detectoren van die welke met behulp van de autofluorescentie controle in Stap 3.3, stelt u de grens ('s) zo nodig met behulp van Tube 7 van tabel 1 en controleer of deze blijft mogelijk om distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg, en CD3 neg CD4 neg cellen met behulp van de aangepaste grens (en). 4. Proliferatie Model Selectie voor de celdeling Toezicht door Dye Verdunning Bepaal de afstand tussen generaties, die afhankelijk is van het aantal kanalen en logaritmische decennia op cytometer. Voor digitale instrumenten, wordt deze waarde, typisch 4 of 5 jaar, bepaald door het aantal bins in de digitale signaalprocessor. Op analoge instrumenten, waarbij het aantal decennia zelden een geheel getal nauwkeurig modelleren vereist precieze aantal decennia experimenteel worden bepaald. Hiertoe worden de gegevens uit een mengsel van gekalibreerd met fluorescerende kralen fabrikant toegewezen relatieve intensiteiten verkregen op dezelfde detector hoogspanning hier gebruikt in het experiment. De positie van het bolletje pieken maakt de kalibratie van de logaritmische schaal in termen van intensity bereik per log decennium. Concreet gebeurt dit door het plotten van het kanaal nummer voor elke kraal soort tegen de stam van de fabrikant-toegewezen waarde. De helling van de best passende rechte lijn voor de kraal gegevenswaarden geeft het aantal relatieve intensiteit eenheden per kanaal. Vermenigvuldigd met het aantal kanalen zal deze waarde dan het aantal log decennia voor de volledige schaal waarvan het aantal kanalen correspondeert met een tweevoudige afname van de intensiteit (bijvoorbeeld dochter generatie afstand) berekend 14. Beslis of u een vaste afstand tussen generaties te gebruiken of om de afstand te zweven. Standard (vaste) instelling zal de generatie afstand waarde bepaald in stap 4.5 de locatie van elke generatie te wijzen en wordt meestal gebruikt wanneer het histogram ontbreekt onderscheiden pieken. Een Vlotter instelling kunt elke generatie piekpositie te bepalen door het histogram vorm en wordt meestal gebruikt wanneer distinguishable generaties pieken zijn evident. Beslis of u een vaste piekbreedte gebruiken voor alle generaties of een drijvend breedte. Een vaste breedte gebruikt de SD berekend voor de niet-gestimuleerde controle monster te modelleren alle generaties en wordt meestal gekozen wanneer het monster ontbreekt onderscheiden generaties pieken. Een drijvende breedte maakt het mogelijk het programma om zelfstandig de SD variëren voor elke generatie en wordt best gebruikt met onderscheiden generaties pieken. Voer een programma met een wildgroei analyse module (hier ModFit LT versie 3.3). Laad de gestimuleerde PKH26 pos-bestand van de dataset te analyseren (bijvoorbeeld een gestimuleerd 96 uur oude kweek van PKH26 pos cellen tegengekleurd als voor Tube 8 in tabel 1). Selecteer de parameters voor analyse in dit geval PKH26 (585/42) op levensvatbare gated (7-AAD neg) CD3 pos lymfocyten en FSC vs SSC aan kleine puin en grote aggregaten (figuur 3) sluiten. Bij het bepalen vandeze regio's voorzichtig zijn om de hoge voorwaartse verstrooiing gebied waar ontploffing doorgaans te vinden zijn en dat CD3 expressie kan down-gemoduleerd worden in gestimuleerde kweken noteren. Maak een nieuwe proliferatie model met behulp van de verspreiding Wizard. Met behulp van de Open Data File (tabblad Start), laadt u de ongestimuleerde PKH26 pos controle bestand en definieer de locatie van de piek kanaal in de ouderlijke verdeling overeenkomt met onverdeelde cellen. Analyseer het bestand voor de ongestimuleerde PKH26 pos controle, wijzend op de waarden voor ouders piekpositie en breedte (standaarddeviatie). Indien een vast piekbreedte (SD) gewenst is, controleer Lock SD. Plaats de PKH26 neg control (bijvoorbeeld een 96 uur oude kweek van PKH26 neg cellen tegengekleurd als voor Tube 7 in Tabel 1). Pas het aantal generaties door de piek-kanaal voor de zwakste generatie boven de PKH26 neg controle. Dit bepaalt de number van dochter generaties het model nauwkeurig passen en is meestal zes tot negen generaties. Open het gegevensbestand voor de gestimuleerde monster (bijvoorbeeld een gestimuleerde 96 uur oude kweek van PKH26 pos cellen tegengekleurd als voor Tube 8 in tabel 1) en bevestigen dat de regio's voor de ouderlijke piek positie en de SD, zoals gedefinieerd in stap 4,7 ongewijzigd blijven. Als vaste generaties afstand gewenst is, selecteert u Standaard model optie, anders selecteer de Floating optie. Analyseer elke experimentele bestand in de dataset met dezelfde model gedefinieerd in stap 4.9. Kleine aanpassingen aan de ouderlijke piekpositie kunnen nodig zijn voor de beste pasvorm als zowel visueel als door de verminderde chi kwadraat (RCS) waarde gedefinieerd. Noteer de gewenste proliferatie metrics gevolg van de best-fit voor elke experimentele bestand in de dataset. Voor een uitgebreide beschrijving van mogelijke metrics zie ref. 22.

Representative Results

Membraan kleurstoffen zoals PKH26 vlek door bijna onmiddellijke opdeling in celmembranen in plaats van door een chemische reactie (voor CFSE) of evenwicht binding (voor antilichamen). Gebrek aan aandacht voor de kritieke punten in figuur 1 kan in donkere of heterogene kleuring van het type getoond in figuur 2. Daarentegen gebruik van geoptimaliseerde etiketteringsvoorwaarden (Figuur 1, Tabel 2) resulteert in heldere homogene verdelingen geschikt voor een verscheidenheid van toepassingen, waaronder cell tracking celdeling toezicht op basis van kleurstof verdunning (figuur 3). Dode / stervende cellen verliezen variërende hoeveelheden van het bijhouden van kleurstof, die kan verbreden en / of scheef dochter generatie intensiteiten en compliceren proliferatie modellering op basis van kleurstof verdunning 3,4,16,18. Het gebruik van een levensvatbaarheid kleurstof wordt daarom aanbevolen bij het verzamelen van kleurstof verdunning van gegevens onder omstandigheden waarbij grote aantallen dode cellen kan vooraf wordenverstuurd, zoals gestimuleerde kweken (figuur 3) of ouder specimens (figuur 4). Omdat het volgen dye labeling typisch haal fluorescentie-intensiteiten enkele orden van grootte hoger dan immunofenotypering, is het belangrijk om passende compensatie controle (tabel 1) omvatten en te verifiëren dat de aanwezigheid van kleurstof niet volgen vermogen om antilichaam positieve en negatieve cellen (Figuur lossen afbreuk 4). om de noodzaak voor excessieve kleurcompensatie voorkomen, verdient het de voorkeur een heldere fluorochroom, of een niet gevonden op cellen van belang, zoals een kleurstof uitgesloten levende cellen, in de spectrale kanaal (en) ter plaatsen om de tracking kleurstof (figuur 4A en B vs. 4C en D). Bij gebruik piek modeling software mate van proliferatie kwantificeren verkrijgen van een goede pasvorm heeft passen aannames in het model de eigenschappen van de kleurstof verdunning profiles geanalyseerd (Figuur 5 en Tabel 3). Met juiste keuze van tracking kleurstoffen en levensvatbaarheid reagentia, is het ook mogelijk om proliferatieve reacties gelijktijdig karakteriseren meerdere lymfocyt subpopulaties. Bijvoorbeeld, zoals geïllustreerd in figuur 6, toevoeging van een 2e volgen kleurstof vereenvoudigt discriminatie tussen regulerende T-cellen (aangeduid met CellVue Claret) en zeer geprolifereerde effector T cellen (gemerkt met CFSE) en biedt een veel grotere details over hun interacties dan kon worden verkregen met 3H-thymidine labeling 18,27. Figuur 1. Algemene membraan etikettering protocol voor PKH26, PKH67 en CellVue kleurstoffen. Partitioneren van deze zeer lipofiele kleurstoffen in cel membranes geschiedt in hoofdzaak direct na het mengen met cellen wanneer kleuring wordt uitgevoerd in de zout-vrije Diluent C voertuig aan kleurstof oplosbaarheid en vlekken efficiëntie te maximaliseren. Zoals samengevat in dit schema voor algemene membraan labeling met PKH26, helder, uniform en reproduceerbaar kleuring is daarom het gemakkelijkst verkregen door: 1) het minimaliseren van de hoeveelheden eiwitten en / of zouten aanwezig zijn in de kleuring en stap 2) met een mengtechniek die verzekert snelle homogene verspreiding van cellen in kleurstof (dwz gelijktijdig alle cellen blootgesteld aan dezelfde concentratie van de kleurstof). Figuur 2. Effect van vlekken omstandigheden op PKH26 fluorescentie distributies (overgenomen uit Ref. 18). Identieke monsters van logaritmisch toe, gekweekte U937 cellen werden gekleurd met PKH26 (eindconcentraties: 1 x 10 7 cellen / ml, 12 – 15 pM PKH26) gedurende 3 min bij kamertemperatuur, met of zonder onmiddellijke menging na de toevoeging van 2x cellen 2x kleurstof. Na wassen werden gekleurde cellen geanalyseerd op een Beckman Coulter flowcytometer met cyaan constant instrumentinstellingen Histogram 1:. Unstained controle met PKH26 detector voltage aangepast om alle cellen op schaal plaats in het eerste decennium met weinig / geen cellen accumuleren in het eerste kanaal. Histogram 2: kleuring bij 15 uM kleurstof met behulp van toevoeging van 2x cellen om kleurstof 2x met onmiddellijke menging resulteerde in een heldere, homogeen gekleurd, symmetrische populatie van cellen in de vierde decennium, met weinig / geen cellen die zich ophopen in het laatste kanaal (gMFI = . 2548, GCV = 26,2%) Histogram 3: kleuring bij 15 uM kleurstof met toevoeging van 2x cellen kleurstof 2x zonder direct mengen tot een verminderde intensiteit en een breder CV (gMFI = 505 , GCV = 116%) als een slecht gekleurde subpopulatie mogelijk door een druppel afgegeven cellen op de wand van de buis niet in de 2x kleurstofoplossing Histogram 4:. Beitsen error tot 3 pl geconcentreerde kleurstof ethanolische stock wordt direct toegevoegd aan cellen in Diluent C 2x zonder verdere menging plaats van 2x gebruikt om een ​​kleurstofoplossing in Diluent C. Dit resulteerde in een uiteindelijke concentratie van 12 kleurstof uM bereiden maar heeft zeer zwak en heterogene kleuring (gMFI = 32,9, GCV = 1,020%). De waargenomen juiste skew waarschijnlijk de gecombineerde effecten van weerspiegelt: i) weinig vermenging door sterk uiteenlopende cel en kleurstof volumes en ii) het feit dat cellen het dichtst bij de kleurstof afleveringspunt worden blootgesteld aan een hogere concentratie kleurstof dan verder weg. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . re 3 "src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg "fo: inhoud-width =" 4.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/> Figuur 3. Gebruik van een probe levensvatbaarheid vereenvoudigt gating van T-celproliferatie profielen hPBMC werden gelabeld met PKH26 (uiteindelijke celconcentratie: 3×10 7 / ml; uiteindelijke kleurstofconcentratie: 10 pM).. Na kweek gedurende 96 uur in de aanwezigheid (gestimuleerde) of afwezigheid (niet gestimuleerde) van anti-CD3 en IL-2 werden de cellen tegengekleurd met anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC en 7-AAD, en werden geanalyseerd op een FACSCalibur flowcytometer (zie referentie 13 voor details). Kleur compensatie werd uitgevoerd op het moment van data-acquisitie met behulp van bekabelde compensatie circuit. De mate van proliferatie werd gemodelleerd als beschreven in stap 4 met de proliferatie in Wizard ModFit LT3.3. Gegevens uit de PKH26 neg control (tabel 1 Tube 7) op elkaar worden geplaatst ter referentie (grijze gevuld histogrammen in kolom 3). De levensvatbaarheid voor de gestimuleerde en stigeformuleerd culturen 76% en 62% (ungated gegevens panelen A en B, respectievelijk). Paneel A. PKH26 gekleurde cellen gekweekt gedurende 96 uur in medium waren gated levensvatbare (7-AAD neg) pos cellen CD3 (R1) omvatten. Naast het antilichaam integratie en 7-AAD dode cel uitsluiting gate, een voorwaartse verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) poort (R2) werd gebruikt om afval en aggregaten sluiten. Let op de afwezigheid van dode cellen in de laatste plot in dit paneel. De best fit model voor de PKH26 proliferatie profiel (kolom 3) gaf een enkele piek met RCS = 2,1 (Donor 6, Tabel 3), wat aangeeft goede symmetrie, en werd gebruikt om de positie te bepalen ouderlijke en uitgangsmaterialen piekbreedte voor analyse van de gestimuleerde monster van deze data set (Panel B). Panel B. overgenomen aliquot van PKH26 gekleurde cellen werd gekweekt met anti-CD3 en IL-2 gedurende 96 uur en afgesloten op dezelfde wijze als in Paneel A. Een model met zwevende piekpositie en drijvende piekbreedte gaf het beste past bij deze gegevens met RCS = 1,3 (Donor 6, tabel 3). Panel C. Dezelfde gegevens bestand in Panel A werd geanalyseerd zonder gebruik van 7-AAD data. Wanneer een primaire FSC vs SSC werd gebruikt om gedeeltelijk te sluiten dode cellen en aggregaten (R2) en een secundaire poort naar CD3 positieve gebeurtenissen (R3) te selecteren, een kleine overblijvende populatie van dode cellen bleef (0,2% van gated gebeurtenissen). De best fit model gaf een enkele piek met RCS = 2,2. Paneel D. Dezelfde gegevens bestand in Panel B gated was in Panel C. de grotere resterende populatie van dode cellen, in de gestimuleerde monster (1,29% van gated events) dit gating strategie. De beste fit model was een met drijvende piekpositie en drijvende piekbreedte (RCS = 1,3). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . ig4.jpg "fo: inhoud-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/> Figuur 4. Effect van fluorochroom keuze en kleurstofconcentratie op de bekwaamheid om immunofenotype lymfocyten gelabeld met PKH26. HPBMC werden geïsoleerd uit 24 uur oud bloed en voorzien PKH26 zoals beschreven in Stap 1, met uitzondering dat kleuring werd uitgevoerd in 12 x 75 mm ronde bodem polystyreenbuizen plaats van 12 x 75 mm conische polypropyleenbuisjes. Direct na labeling met PKH26 werden de cellen tegengekleurd met de aangegeven immunophenotypic en levensvatbaarheid reagentia, en geanalyseerd op een flowcytometer LSRFortessa met de gating strategie van figuur 3A en de volgende optische configuratie: 488 nm laser: FSC-A (488 nm); SSC -A (488/10 BP), FITC-A (530/30 bp), PKH26-A (575/26 bp), 7-AAD-A of PerCP-A (695/40 BP). 640 nm laser: APC-A of TOPRO-3-A (670/14 BP). Kleur compensatie werd uitgevoerd op het moment van data-acquisitie met behulp van BD DiVa software. "Auto"geeft autofluorescentie van het niet-antilichaam controle in de desbetreffende spectrale window (APC voor panelen A en B, PerCP voor Panelen C en D). Gegevens uit de PKH26 neg control (tabel 1 Tube 7) op elkaar worden geplaatst ter referentie (grijs gevulde histogrammen, kolom 5). Na kleuring levensvatbaarheden waren vergelijkbaar voor alle monsters (88-92%). Paneel A. gelabelde cellen met PKH26 bij een uiteindelijke concentratie van 2 pM werden tegengekleurd met anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC en 7-AAD ( buis 8 van tabel 3). Na gating op levensvatbare (7-AAD neg) pos lymfocyten CD3 (kolom 1) en uitsluiting van puin en aggregaten gebaseerd op FSC en SSC (zie Figuur 3A), werd PKH26 intensiteit geëvalueerd in combinatie met APC CD4 (kolommen 2 en 3). Of gecompenseerde (kolom 2) of gecompenseerd (kolom 3) Deze combinatie resulteerde in fluorochroom goede resolutie tussen CD4 pos T-cellen en CD4 T-cellen neg), zoals bevestigd door zowel een no-antibody, autofluorescente controle (Tube 6 van tabel 1; kolom 4) en de twee-kleuren perceel van CD3 vs. CD4 (kolom 6). Panel B. Met dezelfde fluorochroom combinatie zoals in Panel A, maar het verhogen van de uiteindelijke concentratie PKH26 4 uM niet nadelig beïnvloeden om CD4 T-cellen pos oplossen van CD4 T-cellen neg. Panel A C. aliquot van cellen repliceren onafhankelijk gelabeld met PKH26 bij een eindconcentratie van 2 uM werd tegengekleurd met anti-CD3-FITC, anti-CD4-PerCP en TOPRO-3. Na gating op levensvatbare (TOPRO-3 neg) pos lymfocyten CD3 (kolom 1) en uitsluiting van puin en aggregaten gebaseerd op FSC en SSC (zie Figuur 3A), werd PKH26 intensiteit beoordeeld in combinatie met anti-CD4-PerCP (kolommen 2 en 3). Aanzienlijke spectrale overlap van PKH26 in de PerCP kanaal is zichtbaar in de niet-gecompenseerde data (kolom 2), en de resolutie tussen PKH26 pos CD4 <sup> pos pos en PKH26 CD4 negatieve gebeurtenissen marginaal na compensatie wordt toegepast (vergelijk kolom 3 met de no-antilichaam, autofluorescerende control aangegeven in kolom 4). Paneel D. Wanneer PKH26 concentratie wordt verhoogd tot 4 urn is niet meer mogelijk het fluorochroom combinatie Panel C. spectrale overlap gebruiken van PKH26 in de PerCP kanaal dan de intensiteit van het signaal van CD4 (kolom 2) en CD4 pos pos PKH26 events niet meer worden opgelost door CD4 neg pos PKH26 T-cellen (Kolom 3 vs. Kolom 4). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 5. Effect van proliferatie model selectie op. goodness of fit voor dye verdunning profielen hPBMC werden gemerkt met PKH26 (laatste cel concentratie: 3×10 7 / ml; laatste kleurstof concentratie: 10 uM). Na kweek gedurende 96 uur in de aanwezigheid (gestimuleerde) of afwezigheid (niet gestimuleerde) van anti-CD3 en IL-2 werden cellen geoogst tegengekleurd met anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC en 7-AAD en geanalyseerd op een FACSCalibur flowcytometer (zie referentie 13 voor gedetailleerde methoden). Kleurcompensatie werd uitgevoerd op het tijdstip van gegevensverzameling gebruikt hardwired compensatie schakelingen. Panel A. De PKH26 intensiteitsprofiel van een ongestimuleerde 96 uur cultuur Donor 5, een matige responder, was gated zie figuur 3A en gebruikt om de verspreiding ModFit bieden Wizard met een eerste schatting van de positie en breedte van de piek die ongedeelde oudercellen. Panel B. de PKH26 intensiteitsprofiel van een parallelle gestimuleerde 96 uur kweken werd geanalyseerd met de start van schattingenPaneel A en 4 verschillende combinaties van 'proliferatie beheerder "instellingen, die overeenkomen met vaste of variabele intensiteit van de piek, en vaste of drijvende piekbreedtes voor opeenvolgende dochter generaties zoals afgebeeld. Zoals samengevat in tabel 3, het model dat het beste past gaf de waargenomen data (laagste verlaagde chi-square; RCS) was de "floating / floating" combinatie waarin niet alleen piekposities ook standaardafwijkingen dochter generatie pieken konden te variëren (RCS = 1,5). Hetzelfde model gaf de beste pasvorm voor Donor 6, een hoge responder (Figuur 3B en tabel 3). Figuur 6. Toevoegen van een tweede cell tracking kleurstof vereenvoudigt discriminatie tussen effector en regulatoire T cellen in een flow cytometrische onderdrukking assay(Naar Ref 18.) Monocyt uitgeputte lymfocyten bereid uit TRIMA leukaferese filters werden gekleurd met anti-CD127-PE, anti-CD4-PE-Cy7, en anti-CD25-APC en stroming gesorteerd in populaties van effector (Teff.; CD4 pos CD127 heldere CD25 dim), regelgeving (Treg; CD4 pos CD127 dim CD25 pos) en accessoires (CD4-neg) cellen. Gesorteerd Treg cellen gelabeld met CellVue Claret (laatste cel concentratie: 1×10 6 / ml; laatste kleurstof concentratie: 1 uM) en gesorteerd Teff gelabeld met CFSE (laatste cel concentratie: 5 × 10 7 / ml; uiteindelijke kleurstofconcentratie, 5 uM) waren co-gekweekt bij verschillende verhoudingen in de aanwezigheid van anti-CD3, anti-CD28 en bestraalde accessoire cellen. Na 96 uur werden de kweken geoogst, tegengekleurd met anti-CD4-PE-Cy7 en LIVE / DEAD fixable Violet, en geanalyseerd op een flow cytometer en LSRII kleurcompensatie werd uitgevoerd bij de data ACQUISITIEn met behulp van BD DiVa-software (zie referentie 18 voor details met inbegrip van schadevergoeding controles). De proliferatie Indices voor Teff en Treg werden gemodelleerd, zoals beschreven in stap 4, met behulp van de verspreiding Wizard in ModFit LT3.3. Gegevenspunten in panels B en C de gemiddelde ± 1 standaardafwijking van monsters in drievoud Panel A. Representatieve gegevens getoond voor een van de drie monsters in drievoud op Treg:. Teff verhouding van 0,25:1. LIVE / DEAD Muur Violet reagens werd gebruikt om dode cellen (R1, links boven plot; accessoire cellen = rood-bruin, niet-levensvatbare Teff = grijs en niet-levensvatbare Treg = rood) uit te sluiten van alle andere gegevens percelen. CellVue Claret kleuring werd gebruikt om levensvatbare Treg (R4, midden rechts plot; blauw) te onderscheiden van levensvatbare, maar zeer verspreidden Teff (R5, midden rechts perceel; groen). Een enkele parameter CFSE proliferatie profiel voor Teff (linksonder plot) werd gegenereerd door gating op cellen die waren CFSE pos (R5), CD4 pos (R3), levensvatbare (niet R1), en had lymfocyten scAtter eigenschappen (R2). Een parameter CellVue Claret proliferatie profiel Treg werd gegenereerd door gating op cellen die waren CellVue Claret pos (R4), CD4 pos (R3), levensvatbare (niet R1), en had lymfocyt scatter foto (R2). Let op de royale lymfocyt regio (R2) gedefinieerd om lymfocyten ontploffing te nemen. Merk ook op dat het totale aantal cellen te verzamelen afhankelijk van de laagste frequentie populatie van belang. In een celproliferatie experiment waar de populatie van belang kan worden verdeeld over een breed bereik van intensiteiten die tot zeven of acht generaties een groot aantal cellen worden verzameld om nauwkeurig model en bereken het aantal cellen in elke generatie. Bij het bestuderen van zeldzame cellen, kan het nodig zijn gewoon het monsterbuis bijna droog om het maximale aantal gebeurtenissen verzamelen. Voor de hiernaast afgebeeld, om dit te doen resulteerde in een totaal van ~ 25.000 gebeurtenissen, waarvan er 11.923 werden Teff (Proliferatie Index 3,85) en 1380 waren Treg (proliferatie-index 1,83). Paneel B. Zoals verwacht, het verhogen van het aandeel van de Tregs in co-culturen geleid tot een grotere onderdrukking van Teff celproliferatie. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met zowel CellVue Claret gebeitst (vaste lijn) of ongekleurde (stippellijn) Treg, wat aangeeft dat de kleuring CellVue Claret volgen kleurstof geen invloed Treg sterkte. Panel C. Treg relatief anergische en zoals verwacht Wat niet prolifereren wanneer geïncubeerd met anti-CD3, anti-CD28 en accessoire cellen in afwezigheid van Teff cellen (Treg: Teff verhouding van 1:0). Aangezien het percentage Teff in co-culturen neemt (bijvoorbeeld de Treg: Teff daalde), de mate van proliferatie Treg toegenomen. Gewoonlijk een groter foutstaven voor deze data althans gedeeltelijk tijdens de beperkte omvang van proliferatie, waardoor kleinere aantallen verzamelde gebeurtenissen ten opzichte Teff en meer onzekerty in het modelleren van het aantal cellen in elke generatie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Tube No (Doel) PKH26 Antilichaam (en) 7-AAD 1 (Setup, compensatie) – – – 2 (Setup, compensatie) + – – 3 (Setup, compensatie) – – + 4 (compensatie) – CD8-FITC b – 5 (compensatie) – CD8-APC b – 6 (geen Ab controle) + – + 7 (geen tracking kleurstof concontrole) – CD3-FITC CD4-APC of CD19-APC c + 8 (T0 control) + CD3-FITC CD4-APC of CD19-APC c + . Tabel 1 Instrument Setup Controls a a regelopdrachten geschikt zijn voor een 4-kleuren CD4 T-celproliferatie assay met controle:. PKH26 (proliferatie kleurstof), CD3-FITC (pan-T-cel merker), CD4-APC (T-helper celmarker), 7-aminoactinomycin D (7-AAD; dode cel uitsluiting) b Helderder surrogaten voor CD3-FITC en CD4-APC (beter vermogen om schadevergoeding fouten op te sporen) c. Figuur 3:. CD3-FITC en CD19-APC. d Figuur 4: CD3 FITC-en CD4-APC. Celtype Final celconcentratie Final Dye Concentratie </ Strong> Verwijzing hPBMC b 1 x 10 7 / ml 2 pM PKH67 10,17 5 x 10 6 / ml 2 pM PKH26 12 3 x 10 7 / ml 10 pM PKH26 13 5 x 10 7 / ml 30 pM PKH26 18 1 x 10 6 / ml 1 uM CellVue Claret c 18 3 x 10 7 / ml 4 uM CellVue Claret 13 5 x 10 7 / ml 5 uM CellVue Claret 18 Cellen in cultuur 5 x 10 5 / ml 0,1 pM PKH26 (1 ° borstklieren cellen) 8 1 x 10 7 / ml 15 uM PKH26 (U937) 18 1 x 10 7 / ml 12.5 -15 uM PKH26 (U937) 15 1 x 10 7 / ml 1 pM PKH67 (K562) 18 1 x 10 7 / ml 1 pM PKH67 (T cellijnen) 9 1 x 10 7 / ml 10 uM CellVue Claret (YAC-1) 23 Tabel 2. Die geen storing veroorzaakt Membraan-Dye Vlekken Voorwaarden een. Een aangepast en geactualiseerd from Ref. 18. B lage snelheid wash (300 xg) werd gebruikt om bloedplaatjes verontreiniging te minimaliseren. C Treg cellen (flow gesorteerd CD4 CD25 pos pos neg CD127 lymfocyten). Model-instellingen <td colspan = "6"> Model Resultaten Schenker Behandeling Peak Positie SD Ouderlijk Positie Ouderlijk SD # Van Peaks Ingericht RCS PI PF 5 Ongestimuleerde Zweven Zweven 209 4,5 1 5,1 1,0 0 5 Gestimuleerd Vast Vast 209 <td> 4,5 7 35 3,9 31 5 Gestimuleerd Zweven Vast 209 4,5 8 19 4,3 30 5 Gestimuleerd Vast Zweven 209 9,2 6 1,9 3,8 30 5 Gestimuleerd Zweven Zweven 209 9,0 7 1,5 3,7 29 6 Ongestimuleerde Zweven Zweven 205 4,0 1 2,1 1,0 0 6 Gestimuleerd Vast Vast 205 4,0 6 42 6,6 60 6 </ Td> Gestimuleerd Zweven Vast 205 4,0 7 12 7,4 60 6 Gestimuleerd Vast Zweven 205 8,6 6 6,9 6,8 62 6 Gestimuleerd Zweven Zweven 205 6,5 6 1,3 6,5 59 Tabel 3. Impact van proliferatie model op Goodness of Fit (RCS) en Proliferatie Metrics een. Een sample kleuring, het verzamelen van gegevens en gating, zoals beschreven in figuur 3A en B.

Discussion

De hier beschreven methoden zijn die in onze gezamenlijke laboratoria om het meest betrouwbaar optimale resultaten te geven voor hPBMC etikettering gebruik van membraan kleurstoffen 13,16,18 en voor lymfocyten subgroep fenotypering en proliferatie volgen met behulp van membraan of eiwit kleurstoffen 2,11,13,16, 18. Zoals weergegeven in figuren 1 en 2 is helder uniforme etikettering het gemakkelijkst bereikt door beperking van de aanwezigheid van fysiologische zouten en met een mengtechniek die resulteert in snelle, homogene blootstelling van alle cellen met dezelfde concentratie van de kleurstof. Omdat kleuring met membraan kleurstoffen geschiedt door verdeling in de lipide dubbellaag, kunnen andere variabelen die vrije kleurstof concentratie niet verandert ook invloed labelingsefficiëntie. Bijvoorbeeld het labelen in ronde bodem polystyreenbuizen resulteert in minder efficiënte uitwassen van zouten voordat resuspensie in Diluent C en in gereduceerde vrije kleurstof door adsorptie concentratie kleurstof buiswanden namebij lagere kleurstofconcentraties. Beide factoren meestal breder kleuring dan wanneer distributies labeling gebeurt met conische bodem polypropyleenbuisjes (figuren 3, 4 en geeft ongepubliceerde resultaten). Sample leeftijd en het type kan ook van invloed piekbreedte zelfs wanneer geoptimaliseerde vlekken procedures worden gebruikt. Bijvoorbeeld, CV's voor PKH26 pos lymfocyten geïsoleerd uit vers getapt bloed variëren van 14-20% (figuur 3, ref. 13 en niet gepubliceerde resultaten), terwijl cv's voor lymfocyten geïsoleerd van 24 uur oude bloedmonsters of TRIMA pheresis filters bereik 25 tot 30 % (Figuur 4 en Ref. 18).

Kleuring uniformiteit en de mate waarin niet-levensvatbare cellen kunnen worden uitgesloten van de analyse worden getroffen of onderscheiden dochter pieken zijn duidelijk in de kleurstof verdunning profiel, wat invloed keuze van proliferatie model past de waargenomen data (figuren 5 en 6 </strong>). Hoewel ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) wordt hier gebruikt als voorbeeld van software gebruikt om waarden zoals celproliferatie en precursorfrequentie (figuren 3, 5 en 6, tabel 3) te genereren, andere programma modules bevatten te analyseren proliferatie data. Deze omvatten FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) en FlowJo (Boom Star, Inc, Ashland, OR). Al deze programma's een niet-lineaire kleinste kwadraten analyse iteratief de beste fit met de ruwe data door de positie, hoogte en SD (of breedte) van Gaussian pieken van opeenvolgende generaties dochter. Proliferatieve index (PI) en precursorfrequentie (PF) zijn de meest gebruikte maatregelen mate van proliferatie. PI, zoals gedefinieerd door ModFit, is een maat voor de toename van het aantal cellen in de loop van de test, analoog aan de "stimulatie-index" van een thymidine opname assay. PF geeft de fractie van cellen in de eerste population dat aan de prikkel reageerde door proliferatie. Voorzichtigheid is geboden, echter, bij het ​​lezen van de literatuur sinds terminologie varieert enigszins tussen softwarepakketten (bijvoorbeeld, FlowJo en ModFit gebruiken verschillende definities en berekeningen voor wat bedoeld wordt met "Proliferatie Index") 22.

De kritieke problemen hier besproken voor de etikettering en de proliferatie analyse met membraan kleurstoffen worden ook ondervonden bij het gebruik van eiwitten kleurstoffen. Zo moet aandacht voor mengtechniek worden opgemerkt, samen met uitsluiting van dode / stervende cellen, om de uniforme verdeling en onderscheiden pieken dochter verkrijgen met behulp CFSE (figuur 6) 2-4,13,18,24. Geschikte keuze van fluorochromen voor fenotypering en levensvatbaarheidsbeoordeling is ook belangrijk om buitensporige spectrale overlap en onvermogen om antilichaam positieve cellen herkennen, vooral zichtbare emitting eiwit kleurstoffen zoals CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup>. Vermindering van de concentratie kleurstof volgen verlaagt de compensatie problemen in aangrenzende spectrale kanalen, maar beperkt ook het aantal celdelingen die kunnen worden gecontroleerd voordat dochtercel intensiteiten beginnen te overlappen met autofluorescentie. U kunt ook van nieuwere cel bijhouden van kleurstoffen, zoals het verre rode emitterende CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) of violet emitterende CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) kan de schadevergoeding problemen (figuur 6) te verminderen. Ten slotte, hoewel membraan kleurstoffen algemeen de neiging om minder toxiciteit 11,26 vertonen, is het mogelijk om over-label cellen met klasse kleurstof. Het is dus altijd moet worden nagegaan of de concentratie van de gebruikte kleurstof volgen niet de functionaliteit van de cellen worden gevolgd (figuur 6) 3,13,16,18 gewijzigd.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs wil in het bijzonder de volgende personen voor hun technische en intellectuele bijdragen aan de ontwikkeling van deze methoden door de jaren heen bedanken: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Wetenschap en PTI Onderzoek) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc), en Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Zij zouden ook graag de Bowdoin klasse van 2006 bedanken uit de jaarlijkse Cursussen in Onderzoeksmethoden en toepassingen van flowcytometrie, die de gegevens weergegeven in figuur 2 gegenereerd.

Flow cytometrie werd uitgevoerd bij Flow Roswell Park Cancer Institute Cytometry Laboratory, dat deel uitmaakte opgericht door apparatuur subsidies van de NIH Gedeelde Instrument Program, en krijgt steun van de Core Grant (5 P30 CA016056-29) van het NationaalKanker Instituut aan het Roswell Park Cancer Institute, en aan het Abramson Cancer Center Flowcytometrie en celsortering Resource Laboratorium van de Universiteit van Pennsylvania, dat deel uitmaakte opgericht door apparatuur subsidies van de NIH Gedeelde Instrument Program, en wordt ondersteund door NIH # 2P30 CA016520 van het National Cancer Institute. Het werk getoond in de figuren 3 en 5 werd ook gedeeltelijk ondersteund door SBIR subsidie ​​EB00228 van de National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) toegekend aan PTI Research, Inc

Materials

Reagent or equipment Company Catalogue number Comments
      Commercially Purchased
7-Aminoactinomycin D Sigma-Aldrich A9400  
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503  
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150  
Hanks balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14175-079 Calcium and magnesium free, without phenol red
Human IgG Cohn fraction II and III globulins Sigma-Aldrich G-4386  
Mouse anti-human CD3-FITC BD Biosciences 349201 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-APC BD Biosciences 340672 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-PECy7 BD Biosciences 348799 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-FITC BD Biosciences 347313 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-APC Caltag (Life Technologies) MHCD0805 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD19-APC Caltag (Life Technologies) MHCD1905 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD25-APC BD Biosciences 340938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD127-PE BD Biosciences 557938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD3 eBiosciences 16-0037-85 1.0 mg/ml; azide free
Mouse anti-human CD28 eBiosciences 16-0289-85 1.0 mg/ml; azide free
PBS Gibco 21300-058  
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
or
MINI26-1KT		 Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT  
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) Invitrogen (Life Technologies) C34554 Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)
LIVE/DEAD Fixable Violet Invitrogen (Life Technologies) L34955  
Sterile 12 x 75 mm conical
polypropylene tubes & caps		 VWR 60818-102 Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration)
12 x 75 mm round bottom
polystyrene tubes		 Becton Dickinson 21008-936  
Flow cytometer BD Bioscience FACSCalibur
LSRFortessa		 Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm)
Flow cytometer Beckman Coulter LSRII CyAn Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm)
      Laboratory Prepared
7-Aminoactinomycin D,
concentrated stock		 NA NA 1 mg/ml in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C.
7-Aminoactinomycin D,
working stock		 NA NA 100 μg/ml in PBS; prepare daily from 1 mg/ml frozen stock.
IgG block NA NA HBSS + 10 mg/ml Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/ml BSA.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).
  2. Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications. Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).
  3. Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).
  4. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  5. Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O’Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques. J. Immunol. 184, 303-314 (2010).
  6. Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties. Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).
  7. Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy. Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).
  8. Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content. Cell. 140, 62-73 (2010).
  9. Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -. J. Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells. Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).
  10. Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen. J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).
  11. Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells. Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).
  12. Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF). Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).
  13. Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation. Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).
  14. Givan, A. L. A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation. Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).
  15. Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation. Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).
  16. Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution. Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).
  17. Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
  18. Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry. Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).
  19. Fuse, S., Underwood, E. Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry. Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).
  20. Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 111, 3546-3552 (2008).
  21. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).
  22. Roederer, M. Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian. Cytometry. 79A, 95-101 (2011).
  23. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).
  24. Houlihan, D. D., Newsome, P. N. Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease. Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).
  25. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory. T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).

Tags

Optimized StainingProliferation ModelingCell Division MonitoringCell Tracking DyesFlow CytometryImage CytometryStem CellsProgenitor CellsMembrane TransferPrecursor Cell ProliferationImmune Regulatory CellsEffector Cell FunctionCommercially Available DyesMembrane DyesProtein DyesMulticolor StudiesOptimal Use Of Dyes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tario Jr., J. D., Humphrey, K., Bantly, A. D., Muirhead, K. A., Moore, J. S., Wallace, P. K. Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287, doi:10.3791/4287 (2012).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image