Summary

절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

Published: March 08, 2013
doi:

Summary

제시 방법은 절연 쥐 cardiomyocytes의 휴대폰 단축하고 세포 내 칼슘 과도에 절연 환자의 면역 글로불린의 영향을 분석하여, 관계없이 특정 항원의, 확장 성 심근증 환자의 혈장에 기능을 효과적으로 cardiotropic autoantibodies를 감지 할 수있는 방법을 제공합니다.

Abstract

확장 성 심근증 (DCM)은 젊은 성인 1 심장 마비의 주요 원인 중 하나입니다. 독성 물질에 대한 유전 처분 및 박람회가 환자의 약 셋째에서이 질병에 대한 원인을 알려져 있지만, DCM의 출처는 대부분 불분명 남아 있습니다. 이 환자의 상당수에서 심장 epitopes에 대한 autoantibodies가 감지되었으며 질병 2,3의 발병과 진행에 중요한 역할을 의심하고 있습니다. 심장 autoantibodies의 중요성은 immunoadsorption 3-5로 autoantibodies의 제거 후 DCM 환자에서 관찰 hemodynamic 개선에서 빨간 밑줄이 있습니다. 특정 항원의 다양한 이미 2,3를 확인하고 있으며 이러한 목표에 대한 항체가 immunoassays에 의해 검출 될 수있다. 그러나, 이러한 assays은 자극 (및 따라서 기능적 효과)와 autoantibodies을 차단 구별 할 수 없습니다. eviden 명이 증가이 구별이 중요한 6,7입니다 CE. 또한 cardiotropic 항체의 수에 대한 목표는 여전히 미확인이며, 따라서 immunoassays에 의해 감지 할 수 있다고 가정 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 각각의 항원과는 독립적 기능 활성화 cardiotropic 항체의 검출하는 방법을 설립했습니다. 방법의 배경은 일반적으로 포유 동물 8,9 사이에 심장 단백질의 기능 영역에 대한 관찰 높은 호몰 로지입니다. 이 인간의 항원에 대한 감독이 심장 항체 성인 쥐 cardiomyocytes에 DCM 환자에서 IgG의 테스트를 할 수 있습니다 이외의 인간 대상 세포와 함께 상호 반응 제안한다. 우리의 방법은 3 단계로 구성 : 첫 번째는 IgG는 immunoadsorption 열 (PlasmaSelect, Teterow, 독일)에서 얻은 세 파로스 결합 항 IgG 항체를 사용하는 환자의 혈장에서 분리됩니다. 둘째, 성인 cardiomyocytes는 AP를 사용하여 Langendorff 재관류 장치에 collagenase 재관류에 의해 고립되어rotocol은 이전 작품에서 10,11을 수정했습니다. 획득 cardiomyocytes는 laminin 코팅 쏠의 coverglasses에 부착 Fura-2, 쉽게 (CA 2 +) 내용 12 세포 내 칼슘을 관찰하는 셀에 반입 할 수있는 칼슘 선택성 형광 염료를 물들입니다. 마지막 단계에서, 세포 단축 및 CA 2 환자 IgG의 효과 + 필드에 자극을 cardiomyocytes의 과도는 표준 역 형광등에 연결된 상업 myocyte 칼슘, 수축성 모니터링 시스템 (IonOptix, 밀튼, MA, USA)를 사용하여 온라인으로 감시하고 있습니다 현미경.

Protocol

1. 환자 샘플에서 IgG 절연 빈 Econo 팩 칼럼으로 두 ML 환자의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 플라즈마 당 3 ML 항 IgG 세 파로스를 작성하여 미니 immunoadsorption 항목을 준비합니다. IgG 격리는 환자 플라즈마의 최소한 2 ML이 필요합니다. 반 IgG 세 파로스 상단에 필터를 넣고, 열 아래 팁을 열고 잘라 약 1 방울 / 초의 유량에 도달 할 필터를 누르십시오. 열이 부족 보존 솔루션을 보자. <…

Representative Results

분야에서 세포 inotropy의 측정을위한 두 예제는 아래에 myocyte 칼슘 2 + 및 수축성 기록 시스템을 사용하여 성인 cardiomyocytes을 (그림 2) 자극. 그림 3은 제어 측정의 인상을줍니다, 그림 4에있는 동안 cardiodepressive 항체의 효과 있는 환자의 DCM가 표시됩니다. 에서 두 예, 초기 세포 단축 및 CA 2 + EB있는 superfusion 동안 과도은 분석…

Discussion

제시 방법은 불분명 출신 DCM 환자에서 기능적으로 효과적인 심장 autoantibodies를 감지 할 수있는 적절한 방법을 제공합니다. 다른 방법에 비해, 캠프 레벨 6에 미치는 영향에 의해 β1-adrenoceptor에 대한 기능을 활성화 항체의 검출을 예를 들어, 우리의 방법은 특정 에피토프의 독립적입니다. 물론 문학에 설명 된 다른 에피토프 독립 assays는 IE 패치 클램프 기술 또는 절연 Purkinje ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

심혈관 질환의 체액 면역 응답 (-이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)의 Sonderforschungsbereich Transregio 19 일 (SFB/TR19, C2), 경제 및 기술 프로젝트 ZIM – KF 2727801MD0 연방 교육부 및 혁신 능력의 센터에 의해 지원되었다 ZIK – 하이킹, 교육 및 연구, 독일 연방 교육부의 BMBF FKZ 03Z2CN12). 동물과 주택과 실험은 유럽 연구소 동물 과학 협회 (FELASA)의 연구실 동물 과학 (Gesellschaft 털 Versuchstierkunde, GV-SOLAS)와 제휴를위한 학회의 권고에 따라 수행되었다.

Materials

Name of the reagent/equipment Company Catalogue number Comments
Immunosorba preservation solution Fresenius Medical Care 903609211
Collagenase type 2 Cell System LS004176
BSA, fatty acid free Sigma-Aldrich A6003
Laminin Sigma-Aldrich L2020
Fura-2 AM Sigma-Aldrich F0888 1 mg/ml in DMSO
Econo Pac Chromatography Columns BioRad 732-1010
Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane Spectrumlabs 131417
4 well Chambered Coverglass Nunc 155383
Myocyte Calcium and Contractility Recording System IonOptix
IonWizard 6.0 analysis software IonOptix

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Cite This Article
Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (73), e4237, doi:10.3791/4237 (2013).

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