Patojen Vakuoller saflaştırılması gelen<em> Legionella</em>-Enfekte Fagositler
Summary
Bu makale, bozulmamış izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır<em> Legionella</emAmip ve makrofajlardan> içeren vakuoller (LCVs). Iki adımlı bir protokol yoğunluk gradyanı santrifüj yoluyla bir bakteriyel LCV işaretleyici ve daha fazla arıtılmadan karşı bir antikor kullanılarak immüno-manyetik ayırma tarafından LCV zenginleştirme kapsamaktadır.
Abstract
Fırsatçı patojen Legionella pneumophila ayrıca, böylece ciddi pnömoni "Lejyoner hastalığı" 1 neden alveoler makrofajlarda çoğaltır bir amip dirençli bakteri vardır. Protozoon ve memeli fagositler, L. pneumophila belirli bir, çoğaltma-müsamahakar bölmesi, "Legionella içeren vakuol" (LCV) oluşturmak için korunmuş bir mekanizma kullanır. LCV oluşumu ev sahibi hücrelerin içine kadar 275 gibi "efektör" protein translocates bakteriyel ICM / tip IV Nokta salgılama sistemi (T4SS), gerektirir. Effektörler ana proteinler gibi yağlar işlemek ve salgı, endosome ve mitokondriyal organeller 2-4 ile iletişim kurarlar.
LCVs oluşumu indirgemeci şekilde kavramak zor olan bir kompleks sağlam ve atıl işlemi temsil eder. Bütünleştirici bir yaklaşım kapsamlı yolu küresel bir analizini içeren LCV oluşumu, anlamak için gereklidirogen-konak faktörü etkileşimleri ve bunların zamansal ve mekansal dinamikleri. Bu amaca yönelik ilk adım olarak, bozulmadan LCVs saflaştırılmış ve proteomik ve lipidomics tarafından analiz edilmiştir.
Bileşimi ve patojen-içeren vakuollerin oluşumu sıvı kromatografi-kitle spektrometresi ya akuple 2-D jel elektroforezi ile analiz proteomik tarafından araştırılmıştır. Sosyal toprak amip Diktiyostelyum diskodeyum ya da memeli fagositler ya izole Vakuoller Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, Salmonella 9 veya Legionella barındırmaktaydı. 10. Onlar örneğin elektron mikroskobu LCV morfolojisi, bütünlük ve saflık analiz gerektirir Ancak, bu çalışmalarda arıtma protokolü, zaman alıcı ve sıkıcı vardır. Ayrıca, bu protokoller için en patojen vakuol belirli özellikleri istismar yokrichment.
Burada sunulan yöntemi D. istihdam ederek bu kısıtlamaların üstesinden Bir floresan LCV işaretleyici üreten discoideum ve bakteriyel efektör protein SidC, belirleyerek hangi seçici (PtdIns (4) P) 4-fosfat fosfatidilinositol için 3,11 bağlanarak LCV zarına çapalar. LCVs klasik bir Histodenz yoğunluk gradyanı santrifüjleme 12,13 (Şekil 1) tarafından, bir ikinci adımı takip SidC ve manyetik boncuklara bağlanan bir sekonder antikor, karşı afinitesi-saflaştırılmış primer antikor kullanılarak immüno-manyetik ayırma ile bir birinci adım zenginleştirilmiş .
D. izole edilen hafif ticari araç bir proteom çalışma discoideum 13 öncesi LCV oluşumu karışmış edilmemiştir fagositik kesecikler, mitokondri, ER ve Golgi, yanı sıra çok sayıda GTPases ile ilişkili proteinler de dahil olmak üzere birden fazla 560 konak hücrenin protein, ortaya çıkardı. LCVs zenginleştirilmiş ve ile saflaştırılmışprotokolü daha mikroskobu (immunfloresan, elektron mikroskobu), biyokimyasal yöntemler (Western Blot) ve proteomik veya lipidomic yaklaşımlarla analiz edilebilir burada özetlenen.
Protocol
Discussion
Daha önce yayınlanmış yöntem tersine, bu protokolü iki aşamada, birinci bir immüno-manyetik bir yaklaşım tarafından LCVs ayrılması, ve ikinci olarak, yoğunluk gradyanı santrifüjle LCVs ile saflaştırma dayanmaktadır. LCV izolasyon kolayca floresan ile işaretlenmiş bakteri ve GFP üreten hücreleri veya antikor boyama da kullanılan floresan mikroskobu ile takip edilebilir. Burada açıklanan protokol yüksek saflıkta ile LCVs zenginleşmesine neden basit, düz ileri yöntemdir. Önemli olarak, homoj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuarımızda Araştırma Max von Pettenkofer Enstitüsü, Ludwig-Maximilians Üniversitesi Münih, Alman Araştırma Topluluğu (DFG, HI 1511/3-1) ve Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Tıbbi Enfeksiyon Genomics" inisiyatifi tarafından desteklenmiştir ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
