Zuivering van Pathogeen vacuolen uit<em> Legionella</em>-Geïnfecteerde Fagocyten
Summary
Dit artikel beschrijft een werkwijze voor de isolatie en zuivering van intacte<em> Legionella</em>-Met vacuolen (lichte bedrijfsvoertuigen) van amoebe en macrofagen. De twee-staps protocol omvat LCV verrijking van immuno-magnetische scheiding met een antilichaam tegen bacteriële LCV marker en verdere zuivering door dichtheid gradiënt centrifugatie.
Abstract
De opportunistische pathogeen Legionella pneumophila is een amoebe-resistente bacterie, die ook repliceert in alveolaire macrofagen waardoor voor de ernstige longontsteking "veteranenziekte" 1. In protozoa en zoogdieren fagocyten, L. pneumophila maakt gebruik van een geconserveerd mechanisme om een specifieke, replicatie-tolerante compartiment, de "Legionella-bevattende vacuole" (LCV) te vormen. LCV vorming vereist dat de bacteriële ICM / Dot type IV secretie systeem (T4SS), die maar liefst 275 "effector" eiwitten translokeert in gastheercellen. De effectoren manipuleren gastheer eiwitten en lipiden en communiceren met secretie, endosomale en mitochondriale organellen 2-4.
De vorming van een complexe bedrijfsauto, robuuste en redundante proces moeilijk te vatten in een reductionistische wijze. Een integrale aanpak is nodig om volledig te begrijpen LCV vorming, inclusief een globale analyse van het padOgen-host factor interacties en hun temporele en ruimtelijke dynamiek. Als een eerste stap op weg naar dit doel, zijn intact lichte bedrijfswagens gezuiverd en geanalyseerd met behulp van proteomics en lipidomics.
De samenstelling en de vorming van pathogeen bevattende vacuolen is onderzocht door proteoomanalyse met vloeistofchromatografie en 2-D gelelektroforese gekoppeld met massaspectrometrie. Vacuolen geïsoleerd van zowel de sociale bodem amoebe Dictyostelium discoideum of zoogdieren fagocyten koesterde Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 of Salmonella Legionella spp. 10. De zuivering protocollen gebruikt in deze studie zijn tijdrovend en moeizaam, omdat hiervoor bijvoorbeeld elektronenmicroscopie LCV morfologie integriteit en zuiverheid analyseren. Bovendien zijn deze protocollen niet gebruikmaken van specifieke kenmerken van de ziekteverwekker vacuole voor enrichment.
De hier beschreven methode overwint deze beperkingen door gebruik D. discoideum het produceren van een fluorescente marker LCV en door zich te richten de bacteriële effector eiwit SIDC, die selectief ankers om het LCV membraan door te binden aan fosfatidylinositol 4-fosfaat (PtdIns (4) P) 3,11. Bedrijfsauto zijn verrijkt in een eerste stap van immuno-magnetische scheiding met affiniteit-gezuiverde primaire antilichaam tegen SIDC en een tweede antilichaam gekoppeld met magnetische korrels, gevolgd in een tweede stap een klassieke Histodenz dichtheid gradiënt centrifugatie 12,13 (Fig. 1) .
Een proteoom studie van geïsoleerde lichte bedrijfswagens van D. discoideum bleek meer dan 560 gastheercel eiwitten, zoals eiwitten geassocieerd met fagocytaire vesicles, mitochondria, ER en Golgi, alsmede enkele GTPases, die niet in LCV vorming betrokken bij 13. Lichte bedrijfswagens verrijkt en gezuiverd met debeschreven protocol kan hier verder worden geanalyseerd met behulp van microscopie (immunofluorescentie, elektronenmicroscopie), biochemische methoden (Western blot) en proteomics of lipiden benaderingen.
Protocol
Discussion
In tegenstelling tot eerder gepubliceerde werkwijzen wordt dit protocol op twee stappen, eerst de scheiding van bedrijfsauto door een immuno-magnetische benadering, en anderzijds de zuivering van bedrijfsauto door dichtheid gradiënt centrifugatie. De LCV isolatie kan worden gevolgd door fluorescentiemicroscopie bij een fluorescent gelabelde bacteriën en GFP-cellen of antilichamen kleuring gebruikt. Het protocol beschreven is een eenvoudige ongecompliceerde methode waardoor de verrijking van bedrijfsauto met een hoge z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in ons laboratorium werd ondersteund door het Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians Universiteit van München, het Duitse Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medische Infection Genomics"-initiatief ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
