טיהור vacuoles הפתוגן מ<em> הלגיונלה</em> נגועים phagocytes
Summary
מאמר זה מתאר שיטה בידוד וטיהור של שלמה<em> הלגיונלה</em> המכילים vacuoles (LCVs) של אמבה ומקרופגים. פרוטוקול שני שלבים כולל העשרת LCV ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדנים נגד סמן LCV חיידקים טיהור נוספת על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.
Abstract
פתוגן אופורטוניסטי הלגיונלה pneumophila הוא חיידק עמיד אמבה, אשר גם משכפל ב מקרופאגים מכתשיים ובכך גורם לדלקת ריאות חמורה "הליגיונרים" מחלה "1. ב phagocytes protozoan ו יונקים, ל pneumophila מעסיקה מנגנון משומר כדי ליצור מסוים, שכפול התא, מתירנית, "הלגיונלה המכיל vacuole" (LCV). היווצרות LCV דורש חיידקי ICM / דוט סוג מערכת הפרשת IV (T4SS), אשר translocates רבים כמו 275 "מפעיל" חלבונים לתוך התאים המארחים. Effectors לתפעל את החלבונים המארחות, כמו גם שומנים לתקשר עם הפרשה, האברונים endosomal ואת המיטוכונדריה 2-4.
היווצרות LCVs מהווה תהליך מורכב, חזק מיותר, שהיא קשה להבנה בצורה רדוקציוניסטית. גישה אינטגרטיבית נדרש להבין באופן מקיף היווצרות LCV, כולל ניתוח גלובלי של נתיבעוגן מארח גורם האינטראקציות והדינמיקה הזמן והמרחב שלהם. כצעד ראשון לקראת מטרה זו, LCVs שלמים הם מטוהרים ונותחו על ידי proteomics ו lipidomics.
הרכב היווצרות של הפתוגן המכילים vacuoles נחקר על ידי ניתוח proteomic באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית או 2-D ג'ל אלקטרופורזה מצמידים את ספקטרומטר מסה. Vacuoles מבודד או discoideum אדמה חברתית אמבה Dictyostelium או phagocytes יונקים טיפח שושנת יריחו 5, 6 ליסטריה, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 או סלמונלה הלגיונלה spp. 10. עם זאת, הפרוטוקולים טיהור המועסקים מחקרים אלה זמן רב ומייגע, כפי שהם דורשים מיקרוסקופ אלקטרונים למשל לנתח מורפולוגיה LCV, יושר וטוהר. בנוסף, פרוטוקולים אלה אינם מנצלים תכונות ספציפיות של vacuole הפתוגן עבור enrichment.
השיטה המוצגת כאן מתגבר על מגבלות אלה על ידי העסקת ד discoideum לייצר סמן פלואורסצנטי LCV ועל ידי מיקוד SidC חיידקי חלבון מפעיל, אשר סלקטיבי עוגנים קרום LCV באמצעות קשירה phosphatidylinositol 4-פוספט (PtdIns (4) P) 3,11. LCVs מועשרים בשלב הראשון על ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדן זיקה-מטוהרים העיקרי נגד SidC ו נוגדנים משני מצמידים את החרוזים מגנטיים, ולאחר מכן בשלב השני על ידי צנטריפוגה קלאסית צפיפות Histodenz שיפוע 12,13 (איור 1) .
המחקר proteome של LCVs מבודד ד discoideum עולה יותר מ 560 התא המארח חלבונים, כולל חלבונים הקשורים שלפוחית phagocytic, המיטוכונדריה, מיון, Golgi, כמו גם GTPases שונים, אשר לא היו מעורבים ביצירת LCV לפני 13. LCVs מועשר מטוהרים עםפרוטוקול המתואר כאן ניתן לנתח עוד יותר על ידי מיקרוסקופ (immunofluorescence, במיקרוסקופ אלקטרונים), בשיטות ביוכימיות (מערב כתם) וגישות proteomic או lipidomic.
Protocol
Discussion
בניגוד לשיטות שפורסמו בעבר, פרוטוקול זה מבוסס על שני שלבים, 1 הפרדת LCVs ידי גישה חיסונית מגנטי, והשני, טיהור LCVs על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. בידוד LCV ניתן בעקבות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כאשר גם חיידקים שכותרתו fluorescently ו-GFP תאים מייצרי נוגדנים או כתמים משמש. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר במעבדה שלנו נתמך על ידי מקס פון Pettenkofer המכון, לודוויג מקסימיליאן, אוניברסיטת מינכן, קרן המחקר הגרמנית (DFG, HI 1511/3-1) ואת הפרווה Bundesministerium Bildung und Forschung (BMBF) "Genomics זיהום רפואי" היוזמה ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
