La tomografía de fluorescencia difusa ofrece un enfoque relativamente de bajo costo y alto potencial de toda la preclínica<em> En vivo</em> Tumor de imágenes. La metodología de recopilación de datos óptica, calibración y reconstrucción de la imagen se presenta para una guiada por tomografía computarizada sin contacto el dominio del tiempo del sistema usando fluorescentes la orientación de los biomarcadores del tumor epidérmico receptor del factor de crecimiento en un modelo de glioma de ratón.
Pequeños animales de fluorescencia molecular de imágenes (FMI) puede ser una poderosa herramienta para el descubrimiento de medicamentos preclínicos y estudios de desarrollo 1. Sin embargo, la absorción de luz por los cromóforos del tejido (por ejemplo, la hemoglobina, el agua, los lípidos, la melanina) suele limitar la propagación de la señal óptica a través de espesores mayores que unos pocos milímetros 2. En comparación con otras longitudes de onda visibles, la absorción del tejido para el rojo e infrarrojo cercano (IR cercano) absorción de la luz disminuye drásticamente y no la dispersión elástica de la luz se convierte en el dominante del tejido mecanismo de interacción. El desarrollo relativamente reciente de los agentes fluorescentes que absorben y emiten luz en el rango infrarrojo cercano (600-1000 nm), ha impulsado el desarrollo de sistemas de imágenes y modelos de propagación de luz que puede alcanzar todo el cuerpo en tres dimensiones de imagen en pequeños animales 3.
A pesar de grandes avances en este campo, la naturaleza mal planteado de la tomografía por fluorescencia difusa sigue siendo un importanteproblema para la estabilidad, la recuperación de contraste y resolución espacial de las técnicas de reconstrucción de imagen y el enfoque óptimo a FMI en pequeños animales todavía no se ha acordado. La mayoría de los grupos de investigación han invertido en el dispositivo de carga acoplada (CCD), los sistemas basados en la sensibilidad que proporcionan abundante tejido de muestreo, pero subóptima 4-9, mientras que nuestro grupo y algunos otros 10-13 han seguido los sistemas basados en detectores de alta sensibilidad , que en este momento permitir el muestreo tejido denso que se logra sólo a costa de rendimiento de imagen bajo. Aquí se demuestra la metodología para la aplicación de un solo fotón tecnología de detección en un sistema de tomografía de fluorescencia para localizar una lesión cerebral canceroso en un modelo murino.
La fluorescencia de positrones (FT), sistema empleado solo fotón contando con tubos fotomultiplicadores (PMT) y rica en información de dominio de tiempo de detección de la luz en una conformación sin contacto 11. Esto proporciona una col simultánealección de la excitación de transmisión y emisión de luz, e incluye control automático de la exposición de fluorescencia de excitación 14, referencia láser, y co-registro con un pequeño animal de tomografía computarizada (microCT) del sistema 15. Un modelo de ratón desnudo se utiliza para la formación de imágenes. El animal fue inoculado orthotopically con una línea celular humana glioma (U251) en el hemisferio cerebral izquierdo y la imagen después de 2 semanas. El tumor se hizo una fluorescencia mediante la inyección de un trazador fluorescente, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico, una proteína de membrana de la célula sabe que se sobreexpresa en la línea de tumor U251 y muchos otros tipos de cáncer 18. Un segundo, no directo fluorescentes del marcador, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) se inyectó también para dar cuenta de los efectos mediados por los receptores no en la captación de los marcadores dirigidos a proporcionar un medio de cuantificar la unión del marcador y del receptor de la disponibilidad / densidad 27. Guiada por tomografía computarizada, time-dominio algoritmo se utilizó para reconstruir la ubicación de ambos marcadores fluorescentes (es decir, la localización del tumor) en el cerebro del ratón y su capacidad para localizar el tumor fue verificada por contraste mejorado de resonancia magnética.
Aunque demostrado para imágenes de fluorescencia en un modelo de ratón glioma, la metodología presentada en este vídeo se puede extender a diferentes modelos de tumores en diversos modelos animales pequeños potencialmente hasta el tamaño de una rata 17.
Fluorescencia de positrones (FT) es un tema delicado, las radiaciones ionizantes sin técnica de imagen molecular basada en el transporte de luz visible y del infrarrojo cercano a través del tejido biológico. La mayor parte del interés en el FT se ha centrado en su potencial para acelerar el descubrimiento de fármacos y el desarrollo en animales pequeños modelos experimentales 1 y un área clave de investigación ha sido el estudio de la expresión de biomarcadores de cáncer y la respuesta a las terapias moleculares 26. En la actualidad, hay dos enfoques que compiten en el diseño del sistema FT. El diseño más común se basa en la refrigeración del dispositivo de carga acoplada (CCD), cámaras para detección de fluorescencia 4-9. Este diseño proporciona una alta densidad de mediciones, maximizando muestreo de tejido, ya que cada píxel de la cámara CCD puede detectar la luz que ha viajado un camino único a través del tejido. Sin embargo, las cámaras CCD tienen un rango dinámico limitado y el ruido de lectura limita su mayor sensibilidad. El segundo diseño evita el potencial limitación ciones de detección cámara CCD mediante el empleo de alta sensibilidad de un solo fotón tecnología recuento basado en el uso de detectores tales como tubos fotomultiplicadores o fotodiodos de avalancha 10-13. El inconveniente de estos métodos de detección más sensible es que cada detector sólo puede recoger la luz en un solo punto, por lo tanto, para lograr muestras de tejido denso, ya sea muchos detectores tienen que ser utilizados (que es muy caro), o muchas proyecciones tienen que ser fotografiada con el mismo detector (que puede llevar mucho tiempo). Mientras que el nivel óptimo de muestras de tejido para el FT pequeño animal no ha sido acordado, y puede variar en una base de caso por caso, se ha acordado que la instrumentación de fotón único conteo es más adecuado para explorar los límites de sensibilidad de FT en términos de su capacidad para detectar bajas concentraciones de los marcadores moleculares. En este estudio, se propone una metodología para llevar a cabo FT utilizando un solo fotón de instrumentación de detección de cómputo para localizar tumores en ratones.
ent "> Hay cuatro pasos críticos implicados para producir conjuntos de datos robustas con el tiempo-correlacionada fotón único FT recuento. La primera es la aplicación de un procedimiento de calibración adecuado y directo. En la metodología presentada, las sensibilidades respectivas de cada canal de detección se tienen en cuenta por recoger una medición de base de luz de excitación transmitida a través de una línea-difusor diseñado para dirigir fracciones iguales de luz a cada detector 15. Además, la luz detectada durante un experimento es continuamente calibrado a la referencia de láser, tanto en términos de intensidad y la media . tiempo, lo que podría fluctuar con el tiempo, por el funcionamiento de un canal de láser de referencia 11,15 El segundo paso crítico es la colección precisa y co-registro de imágenes anatómicas para guiadas reconstrucciones fluorescencia Los datos FT solo no ofrece ninguna información anatómica.; por lo tanto, con el fin de crear un modelo de transporte de la luz que se puede utilizar para reconstruir la LOcatión de fuentes fluorescentes dentro de un espécimen de la fluorescencia detectada en la superficie de la muestra, la anatomía de la muestra en relación con el sistema FT debe ser exactamente conocida. En nuestro sistema, la información anatómica es adquirido por un sistema de tomografía computarizada micro con coordenadas espaciales que han sido registrados espacialmente con las del sistema de FT 15,20. El paso crítico tercera consiste en garantizar que una exposición óptima (es decir, el tiempo total de detección de fotones por cada proyección de láser) se emplea en cada posición de la fuente-detector. Esto es importante por dos razones: primero, para asegurar que no es adecuada relación señal-ruido en cada posición de detección y segundo para evitar la saturación del detector, que podría dañar las unidades de detección. Con el fin de conseguir una exposición óptima en cada posición del detector, un control automático de exposición se emplea, que esencialmente triangula la exposición óptima de dos, de baja señal exposiciones 14. El cuarto críticopaso de la metodología se hace referencia a los datos recogidos de fluorescencia a la cantidad de luz de excitación transmitida. Esta referencia se llama a menudo la relación del Born, y proporciona muchos beneficios para los pies, con la principal es la mitigación de errores de incompatibilidad de datos en modelos 23,24. El sistema presentado fue diseñado para detectar la luz de excitación tanto de fluorescencia y transmitida simultáneamente por la canalización de la luz en cada canal de detección en 2 tubos fotomultiplicadores separadas. Al hacer esto, evitar cualquier efecto de movimiento sobre la exactitud de la relación de Born.Con un conjunto de datos robusta que la mano, la reconstrucción de la imagen de los datos de dominio de tiempo consiste en resolver el problema inverso de la malla de elementos finitos que tiene la expresión:
d = Jx
donde d es un vector con n x m elementos de n detector de fuente de las proyecciones y el tiempo m TPSF puertas; J es un n x m-por-l sensibilidad matriz (o Jacobiana), para los nodos l en la malla, y x es el vector de las propiedades ópticas de fluorescencia en cada nodo, teniendo l tamaño d es los datos calibrados recogidos durante el experimento y J es simulado usando la solución de elementos finitos. a la aproximación del tiempo de difusión dominio de transporte de fluorescencia 25. La dimensión temporal de J está también convolucionada con los detectores específicos funciones del instrumento de respuesta. X es una representación del mapa de fluorescencia de interés y se resuelve para el uso de un Levenberg-Marqardt no negativo enfoque de mínimos cuadrados con Tikhonov regularización 15.
La metodología presentada aquí, que describe un procedimiento capaz de localizar tumores marcadas fluorescentemente en ratones utilizando altamente sensibles conteo de fotones detección por fluorescencia, tiene el potencial para empujar los límites de FT. En un estudio anterior, el potencial de emplear esteenfoque en las grandes-que-ratones modelos animales, como ratas, así como una mejor sensibilidad en el diseño de sistemas existentes en el tamaño del ratón-las muestras, se ha demostrado 17. La aplicación inmediata de este enfoque sería que el control de la expresión de biomarcadores en vivo en pequeños modelos animales de tumores para evaluar la eficacia del fármaco en un medio de alto rendimiento. La capacidad del sistema para excitar y detectar la fluorescencia a longitudes de onda múltiples permite la detección simultánea de múltiples marcadores fluorescentes. Otros marcadores fluorescentes proporcionan un medio para interrogar a los múltiples aspectos de una patología, al mismo tiempo, o podrían ser utilizados, como en este estudio, a emplear métodos de imagen más cuantitativos, tales como los métodos de doble reportero de la medición en el potencial de unión in vivo, un marcador de densidad de los receptores 26,27.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo ha sido financiado por donaciones Instituto Nacional del Cáncer R01 CA120368, R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) y K25 CA138578 (FL), y los Institutos Canadienses de la adjudicación de Investigación en Salud beca postdoctoral (KMT ). El desarrollo del sistema de tomografía de fluorescencia fue parcialmente financiado por las tecnologías avanzadas de investigación (Montreal, QC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
IRDye 800CW-EGF | LI-COR Biosciences | 926-08446 | |
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester | Life Technologies | A20106 | Reacted with water to minimize non-specific binding |