Computertomographie-gesteuerte Time-Domain diffuse Fluoreszenz-Tomographie in der Kleintiere für die Lokalisierung von Krebs-Biomarker
Summary
Diffuse Fluoreszenz-Tomographie bietet eine relativ kostengünstige und potenziell hoher gesamten Ansatz für präklinische<em> In-vivo-</em> Tumordarstellung. Die Methodik der optischen Datenerfassung, Kalibrierung und Bildrekonstruktion für eine Computertomographie-geführte berührungslosen Zeitbereichs-System unter Verwendung von fluoreszierenden Ausrichtung der Tumorbiomarker epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor in einem Maus-Gliom-Modell dargestellt.
Abstract
Kleintier-Fluoreszenz molekulare Bildgebung (FMI) kann ein mächtiges Werkzeug für die präklinische Wirkstoffforschung und-entwicklung Studien 1 sein. Jedoch Lichtabsorption durch Gewebe Chromophore (zB Hämoglobin, Wasser, Lipide, Melanin) typischerweise begrenzt optischen Signalausbreitung durch Dicken größer als ein paar Millimeter 2. Im Vergleich zu anderen sichtbaren Wellenlängen, Gewebeabsorption für rote und nahes Infrarot (NIR-) Lichtabsorption dramatisch abnimmt und nicht-elastische Streuung wird die dominante Licht-Gewebe-Wechselwirkung Mechanismus. Die relativ neue Entwicklung von fluoreszierenden Mittel, und absorbieren Licht im nahen IR-Bereich (600-1000 nm), hat die Entwicklung von Bildverarbeitung und Lichtausbreitung Modelle von ganzen Körper dreidimensionalen Bildgebung in Kleintieren 3 kann erreicht angetrieben.
Trotz großer Fortschritte in diesem Bereich bleibt die schlecht gestellte Natur der diffuse Fluoreszenz-Tomographie eine deutlicheProblem für die Stabilität, Kontrast Erholung und räumliche Auflösung der Bildrekonstruktionstechniken und die optimale Herangehensweise an FMI bei Kleintieren muss noch vereinbart werden. Die Mehrheit der Forschungsgruppen haben in charge-coupled device (CCD)-basierte Systeme, die reichlich vorhandenen Gewebe-Sampling aber suboptimal Empfindlichkeit 4-9 liefern investiert, während unsere Gruppe und ein paar andere Systeme auf Basis von 10-13 sehr hohe Empfindlichkeit Detektoren verfolgt haben , dass zu diesem Zeitpunkt erlauben dichtem Gewebe Probenahme nur auf Kosten der niedrigen Bildgebung Durchsatz erreicht werden. Hier zeigen wir die Methodik für die Anwendung Single-Photon-Detection-Technologie in einem Fluoreszenz-Tomographie-System zu lokalisieren, eine krebsartige Hirnverletzung in einem Mausmodell.
Die Fluoreszenz-Tomographie (FT)-System verwendet Einzelphotonenzählung mit Photomultiplier (PMT) und informative Zeitbereich Lichterfassungseinrichtung in einem berührungslosen Konformation 11. Dies ermöglicht eine gleichzeitige colwahl der übertragenen Anregung und Emission, und beinhaltet eine automatische Belichtungssteuerung Fluoreszenzanregung 14, Laser-Referenzierung, und Co-Registrierung mit einem kleinen Tier Computertomographie (MicroCT) System 15. Eine Nacktmaus-Modell wurde für die Bildgebung verwendet. Das Tier wurde mit einem orthotop menschliche Gliom-Zelllinie (U251) in der linken Gehirnhälfte geimpft und bebildert 2 Wochen später. Der Tumor wurde durch Einspritzen eines Fluoreszenz-Tracer fluoreszieren, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) gezielt auf epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor, ein Zellmembranprotein bekannt, in der U251 Tumorzelllinie überexprimiert und vielen anderen Krebsarten 18. Eine zweite, ungezielte fluoreszierender Tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) wurde ebenfalls zur Rechenschaft für Nicht-Rezeptor-vermittelte Effekte injiziert auf die Aufnahme der gezielten Tracer, ein Mittel zur Quantifizierung der Bindung des Tracers und Rezeptor-Verfügbarkeit / Dichte liefern 27. Eine CT-gesteuerte, time-Domäne-Algorithmus wurde verwendet, um den Standort der beiden fluoreszierenden Tracern (dh die Lage des Tumors) im Gehirn der Maus und ihre Fähigkeit zur Lokalisation des Tumors durch Kontrastmittel-Kernspintomographie wurde bestätigt, zu rekonstruieren.
Obwohl für die Fluoreszenz-Bildgebung in einem Gliom Mausmodell gezeigt, kann die Methode in diesem Video vorgestellt, um verschiedene Tumor-Modellen in verschiedenen kleinen Tiermodellen potenziell bis zu der Größe einer Ratte 17 verlängert.
Protocol
Discussion
Fluoreszenz-Tomographie (FT) ist ein sensibler, ionisierende Strahlung frei molekularen Bildgebungsverfahren auf sichtbaren und nahen infraroten Lichts Transport durch biologische Gewebe basieren. Die meisten der Interesse an FT hat sich auf sein Potenzial zur Wirkstoffforschung und-entwicklung in kleinen tierexperimentellen Modellen 1 und ein zentraler Bereich der Forschung war die Erforschung der Krebs-Biomarker-Expression und dem Ansprechen auf molekulare Therapien zu beschleunigen hat 26 konzentriert. Derzeit gibt es zwei konkurrierende Ansätze, um FT-System-Design. Die häufigste basiert auf gekühlten charge-coupled device (CCD) für die Fluoreszenzdetektion 4-9 bezogen. Dieser Entwurf stellt eine hohe Dichte von Messungen, die Maximierung Gewebeentnahmevorrichtung da jedes Pixel in der CCD-Kamera kann Licht, das einen eindeutigen Pfad gereist ist durch das Gewebe zu erfassen. Allerdings haben CCD-Kameras einen begrenzten Dynamikbereich und Ausleserauschen schränkt ihre ultimative Empfindlichkeit. Das zweite Design vermeidet die potenzielle Einschränkungen gen der CCD-Kamera Detektion unter Verwendung hochempfindliche Single-Photon-Zähl-Technologie auf die Verwendung solcher Detektoren SEV-Röhren oder Avalanche-Photodioden 10-13 bezogen. Der Nachteil dieser empfindlichere Nachweismethoden ist, dass jeder Detektor kann nur sammeln Licht an einem einzigen Punkt, daher zu dichtem Gewebe Probenahme erreicht werden können, entweder viele Detektoren zu verwenden (was sehr teuer ist), oder viele Projektionen müssen abgebildet werden mit dem gleichen Detektor (das kann sehr zeitaufwändig sein). Während das optimale Niveau der Gewebeentnahme für Kleintier-FT noch nicht vereinbart worden ist, und darf nur von Fall zu Fall variieren, wird vereinbart, dass Single-Photon-Counting Instrumentierung besser geeignet ist, um die Empfindlichkeit Grenzen der FT in Bezug erkunden seiner Fähigkeit, geringen Konzentrationen molekularer Marker zu detektieren. In dieser Studie stellen wir eine Methodik für die Durchführung von FT mit Single-Photon-Counting-Erkennung Instrumentierung zu lokalisieren Tumoren in Mäusen.
ENT "> Es gibt vier wichtige Schritte erforderlich, um robuste Datensätze mit zeitkorrelierten Single-Photon-Counting-FT zu produzieren. Die erste ist die Anwendung eines geeigneten und unkomplizierte Kalibrierung. In der vorgestellten Methodik werden die jeweiligen Sensibilitäten der einzelnen Detektionskanal entfielen durch Sammeln einer Baseline-Messung von Anregungslicht durch eine Leitung-Diffusor ausgebildet, um gleiche Anteile der Lichtmenge für jeden Detektor 15 zu richten übertragen. Ferner ist das detektierte Licht während eines Experiments kontinuierlich an den Laser Referenz kalibriert, sowohl in Bezug auf Intensität und Mittel .-Zeit, die im Laufe der Zeit schwanken kann, durch den Betrieb eines Lasers Referenzkanal 11,15 Die zweite kritische Schritt ist die genaue Erfassung und Co-Registration der anatomischen Bildgebung für geführte Fluoreszenz Rekonstruktionen Der FT-Daten allein bietet keine anatomische Information. daher, um ein Modell der leichten Transport zu schaffen, die verwendet werden, um die lo rekonstruierenKation Leuchtstofflampen in einer Probe aus der detektierten Fluoreszenz an der Oberfläche der Probe, muss die Anatomie der Probe in Bezug auf die FT-System genau bekannt sind. In unserem System wird die anatomische Information von einem Mikro-Computertomographie mit räumlichen Koordinaten, die räumlich sind mit denen des FT-System registriert 15,20 erworben. Der dritte kritische Schritt sorgen, daß sich eine optimale Belichtung (dh insgesamt Photonendetektion für jede Laserprojektionseinheit) in jedem Quelle-Detektor-Position eingesetzt wird. Dies ist aus zwei Gründen wichtig: erstens, um sicherzustellen, dass es ein ausreichendes Signal-Rausch-bei jeder Erfassung Position und der zweiten zu dem Detektor Sättigung, die die Detektion Geräte beschädigen könnten, zu vermeiden. Um eine optimale Belichtung bei jedem Detektor Position zu erreichen, eine automatische Belichtungssteuerung verwendet wird, die im wesentlichen trianguliert die optimale Belichtung von zwei, Low-Signal Forderungen 14. Das vierte kritischeSchritt der Methode verweist die gesammelten Fluoreszenzdaten auf die Menge der übertragenen Anregungslicht. Diese Referenzierung wird oft das Verhältnis Born genannt, und bietet viele Vorteile für die FT, mit dem im wesentlichen darauf eine Milderung der Modell-Daten Fehlanpassungsfehlern 23,24. Das vorgestellte System wurde entwickelt, um sowohl Fluoreszenz-und Durchlicht Anregungslicht gleichzeitig zu erkennen, indem jedes Jahr das Licht in jeden Detektionskanal in 2 separate Photovervielfacherröhren. Auf diese Weise vermeiden wir irgendwelche Auswirkungen von Bewegung auf die Richtigkeit der Born-Verhältnis.Mit einem robusten Datensatz es Hand, beinhaltet Bildrekonstruktion der Time-Domain-Daten Lösung des inversen Problems der Finite-Elemente-Netz mit dem Ausdruck:
d = Jx
wobei d ein Vektor mit N x M-Elemente für n Quelle-Detektor-Vorsprünge und m TPSF Zeitgatter, J ist ein n x m-mal-l Sensitivitätsmatrix (oder Jacobi), für l Knoten in dem Netz, und x der Vektor der Fluoreszenz optischen Eigenschaften in jedem Knoten, mit einer Größe L d die kalibrierten Daten während des Experiments und J gesammelt simuliert mit Hilfe der Finiten-Elemente-Lösung. in den Zeitbereich Diffusionsnaeherung der Fluoreszenz Transport 25. Die Zeit-Dimension von J ist auch mit dem Detektor spezielles Instrument Antwortfunktionen gefaltet. X ist eine Darstellung der Fluoreszenz Karte von Interesse ist und für die Verwendung eines Levenberg-Marqardt nichtnegative kleinsten Quadrate mit Tikhonov Regularisierung 15 gelöst.
Die hier vorgestellten Methode, die beschreibt ein Verfahren zur Lokalisierung der Lage fluoreszenzmarkierten Tumoren in Mäusen mit hochsensiblen Photonenzählung Fluoreszenzdetektion, hat das Potential, die Grenzen der FT zu drücken. In einer früheren Studie, beschäftigt das Potenzial diesesAnsatz in larger-than-Mäusen Tiere Modelle, wie Ratten, sowie eine verbesserte Empfindlichkeit gegenüber bestehenden System-Designs in Maus-Größe Proben wurde 17 demonstriert. Die unmittelbare Anwendung dieses Ansatzes würde für die Überwachung der Biomarker-Expression in vivo in kleinen Tiertumormodellen zu der Wirksamkeit von Arzneimitteln in einem Hochdurchsatz-Mittel zu beurteilen. Die Fähigkeit des Systems zu erregen und erkennen Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer Fluoreszenzmarker. Zusätzliche fluoreszierende Marker ein Mittel zur Abfrage mehrerer Aspekte einer Pathologie, gleichzeitig, oder könnte verwendet werden, wie in dieser Studie werden, um weitere quantitative Bildgebung Ansätze wie Dual-Reporter Methoden zur Messung der in vivo-Bindung Potenzial, ein Marker der Rezeptordichte beschäftigen 26,27.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Cancer Institute Zuschüsse R01 CA120368, R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) und K25 CA138578 (FL) finanziert worden ist, und kanadischen Institutes of Health Research Postdoc-Stipendium ausgezeichnet (KMT ). Die Entwicklung der Fluoreszenz-Tomographie-System wurde teilweise durch die Advanced Research Technologies (Montreal, QC) gefördert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| IRDye 800CW-EGF | LI-COR Biosciences | 926-08446 | |
| Alexa Fluor 647, succinimidyl ester | Life Technologies | A20106 | Reacted with water to minimize non-specific binding |
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