Нейронных цепей топографически организованы в функциональные отсеки с конкретным молекулярным профилей. Здесь мы предлагаем практические и технические меры для выявления глобальной топографии мозга с помощью универсального подхода wholemount иммуногистохимического окрашивания. Мы продемонстрировать полезность метода с помощью хорошо понятных цитоархитектонике и схема мозжечка.
Повторяется и хорошо понимал сотовой архитектуры мозжечка делают его идеальной модели системы для изучения мозга топографии. В основе ее относительно равномерным цитоархитектонике это сложный комплекс парасагиттальных областях генов и экспрессии белков. Молекулярной фрагментации мозжечка отражается на анатомические и функциональные организации афферентных волокон. Чтобы в полной мере оценить сложность мозжечка организации мы ранее уточнены wholemount подход окрашивания высокой пропускной способности анализа паттернов дефектов мыши мозжечка. Этот протокол описывает подробно реактивы, инструменты и практические шаги, которые являются полезными для успешного выявление закономерностей экспрессии белка во взрослом мозжечке мыши с помощью wholemount окрашивания. Шаги, подчеркнул здесь продемонстрировать полезность этого метода с использованием выражения zebrinII / aldolaseC как пример того, как мелкий рельеф мозга могут быть выявлены вродной трехмерной конформации. Описываются также адаптации к протоколу, что позволяет для визуализации экспрессии белка в афферентных проекций и большой мозжечка для сравнительного исследования молекулярной топографии. Для иллюстрации этих приложений, данные из афферентных окрашивания мозжечка крысы включены.
Мы описали технические детали, необходимые для успешного окрашивания wholemount помощью универсальной иммуногистохимический подход для выявления экспрессии белка в развивающемся и взрослом мозге. Используя этот подход, сложных молекулярных моделей выражения могут быть проанализирован?…
The authors have nothing to disclose.
RVS поддерживает новый следователь запуска средства Альберта Эйнштейна Медицинского колледжа университета Ешива.
Materials | Function in protocol |
Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2) | Allows for consistent and slow perfusion. |
Sharp-tip Scissors (FST/14081-08) | General use in perfusion and dissection. |
Blunt-tip Forceps (FST/91100-12) | To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle. |
Forceps (FST by Dumont AA/11210-10) | For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection. |
Nutator (Fisher Scientific) | Used to keep tissue in motion during incubation periods. |
1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube) | All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion. |
Perforated spoon (FST/10370-17) | Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution. |
Leica MZ16 FA microscope | Used to examine wholemount staining. |
Leica DFC3000 FX camera | Used to capture wholemount images. |
Table 1.
Example calendar for a typical wholemount experiment | ||||||||
Day 1 | Dent’s fix, room temperature, 8 hrs | Dent’s bleach, 4°C, overnight | ||||||
Day 2 | 100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each | 100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min |
100% MeOH, -80°C, overnight | |||||
Day 3 | 50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min | 15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min | 100% PBS, room temperature, 60-90 min | 10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min | 100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each | PMT, 4°C, overnight | ||
Day 4-5 | PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs | |||||||
Day 6 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex) | ||||||
Day 7 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PBT, room temperature, 2 hrs | Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized |
Table 2.
Recipes (*=prepare fresh every time) | |
PBS (phosphate buffered saline) | 0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417) |
PFA (Paraformaldehyde) | Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353) |
Dent’s Fixative3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) |
Dent’s Bleach3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide |
Enzymatic Digestion | 10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS. |
PBST | PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.) |
PMT25* | PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
PBT25* | PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
DAB* | Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction). |
ABC Complex Solution | Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000) |
Table 3.