Wholemount المناعية للكشف عن تضاريس دماغية معقدة
Summary
ويتم تنظيم الطوبوغرافي الدوائر العصبية في المقصورات وظيفي مع التشكيلات الجزيئية محددة. هنا، ونحن نقدم الخطوات العملية والتقنية للكشف عن العالمية تضاريس الدماغ باستخدام تنوعا wholemount نهج تلطيخ المناعى. نحن إثبات فائدة من طريقة استخدام التهندس الخلوي مفهومة جيدا والدوائر المخيخ.
Abstract
بنية متكررة ومفهومة جيدا الخلوية من المخيخ جعله نظاما نموذج مثالي لاستكشاف تضاريس الدماغ. الكامنة وراء التهندس الخلوي بصورة موحدة نسبيا هي مجموعة معقدة من المجالات مجاور للسهمي من الجينات والبروتينات. وينعكس هذا التقسيم الجزيئية للمخيخ من قبل المنظمة التشريحية والوظيفية للألياف وارد. لنقدر تماما مدى تعقيد منظمة المخيخ نحن صقلها من قبل نهج تلطيخ wholemount لتحليل إنتاجية عالية من العيوب الزخرفة في المخيخ الماوس. هذا البروتوكول يصف بالتفصيل الكواشف، والأدوات، والخطوات العملية التي هي مفيدة للكشف عن أنماط التعبير بنجاح بروتين في المخيخ فأر بالغ باستخدام wholemount المناعية. سلط الضوء على خطوات تثبت هنا فائدة هذه الطريقة تستخدم للتعبير عن zebrinII / aldolaseC كمثال على الكيفية التي يمكن بها كشف تضاريس الدقيقة للدماغ في تقريرهاأصلي ثلاثي الأبعاد التشكل. كما وصفت هي التعديلات على البروتوكول الذي يسمح لتصور من بروتين تعبير وارد في التوقعات ومخيخات كبير للدراسات المقارنة للالتضاريس الجزيئية. لتوضيح هذه التطبيقات، يتم تضمين البيانات من تلطيخ وارد من المخيخ الفئران.
Protocol
1. الإرواء الحيوانية والتشريح المخيخ اعتمادا على البروتين، قد نضح تكون ضرورية ل1،2 تلطيخ ناجحة. Transcardiac نضح هو الغازية، وعدم بقاء الإجراء الذي يتطلب الاستخدام السليم للأدوية التخدير. التدريب الصحيح، وموافقة المؤ…
Discussion
وقد وصفت لنا التفاصيل الفنية اللازمة لتلطيخ wholemount ناجحة باستخدام نهج متعدد الاستعمالات المناعى للتعبير عن بروتين كاشفة في الدماغ النامية وتعليم الكبار. باستخدام هذا النهج، يمكن تحليل معقد أنماط التعبير الجزيئية وتضاريس الدماغ تقدير من دون الحاجة إلى شاقة وتستغرق ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم RVS بواسطة محقق جديد لبدء الأموال من كلية ألبرت اينشتاين للطب في جامعة يشيفا.
Materials
| Materials | Function in protocol |
| Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2) | Allows for consistent and slow perfusion. |
| Sharp-tip Scissors (FST/14081-08) | General use in perfusion and dissection. |
| Blunt-tip Forceps (FST/91100-12) | To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle. |
| Forceps (FST by Dumont AA/11210-10) | For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection. |
| Nutator (Fisher Scientific) | Used to keep tissue in motion during incubation periods. |
| 1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube) | All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion. |
| Perforated spoon (FST/10370-17) | Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution. |
| Leica MZ16 FA microscope | Used to examine wholemount staining. |
| Leica DFC3000 FX camera | Used to capture wholemount images. |
Table 1.
| Example calendar for a typical wholemount experiment | ||||||||
| Day 1 | Dent’s fix, room temperature, 8 hrs | Dent’s bleach, 4°C, overnight | ||||||
| Day 2 | 100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each | 100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min |
100% MeOH, -80°C, overnight | |||||
| Day 3 | 50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min | 15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min | 100% PBS, room temperature, 60-90 min | 10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min | 100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each | PMT, 4°C, overnight | ||
| Day 4-5 | PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs | |||||||
| Day 6 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex) | ||||||
| Day 7 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PBT, room temperature, 2 hrs | Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized | |||||
Table 2.
| Recipes (*=prepare fresh every time) | |
| PBS (phosphate buffered saline) | 0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417) |
| PFA (Paraformaldehyde) | Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353) |
| Dent’s Fixative3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) |
| Dent’s Bleach3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide |
| Enzymatic Digestion | 10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS. |
| PBST | PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.) |
| PMT25* | PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| PBT25* | PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| DAB* | Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction). |
| ABC Complex Solution | Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000) |
Table 3.
References
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
- Kim, S. -. H., Che, P., Chung, S. -. H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2006).
- Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development. 105, 61-74 (1989).
- Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri. J. Anat. 204, 257-269 (2004).
- Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).
- Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).
- Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum. Cerebellum. 10, 409-421 (2011).
- Larouche, M., Hawkes, R. From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation. Cerebellum. 5, 77-88 (2006).
- Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development. J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).
- Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis. Development. 138, 1207-1216 (2011).
- Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse. Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).
- Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry. Brain Res. 1222, 106-117 (2008).
- Marzban, H., Hawkes, R. On the architecture of the posterior zone of the cerebellum. Cerebellum. 10, 422-434 (2011).
- Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum. J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).
- Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4. J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).
- Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease. J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).
- Sarna, J. R., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse. Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).
- El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis. Development. 135, 2981-2991 (2008).
- Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).
- Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest. Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2. Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).
- Davis, C. A. Whole-mount immunohistochemistry. Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).
Tags
Wholemount ImmunohistochemistryBrain TopographyCerebellumCellular ArchitectureGene Expression DomainsProtein Expression DomainsMolecular CompartmentalizationAfferent FibersPatterning DefectsMouse CerebellumWholemount Staining ApproachProtein Expression PatternsZebrinII/aldolaseC ExpressionThree-dimensional ConformationAfferent ProjectionsComparative StudiesMolecular TopographyRat Cerebellum
Cite This Article
White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography. J. Vis. Exp. (62), e4042, doi:10.3791/4042 (2012).