אימונוהיסטוכימיה Wholemount על טופוגרפיה חושפני המוח קומפלקס
Summary
מעגלים עצביים מאורגנים מבחינה טופוגרפית עם פרופילים מולקולריים ספציפיים לתאים פונקציונליים. כאן, אנו מספקים את הצעדים המעשיים והטכניים של חשיפת הטופוגרפיה המוח העולמי באמצעות גישה צדדי wholemount מכתים immunohistochemical. אנו להדגים את התועלת של השיטה באמצעות cytoarchitecture מבינים היטב ואת המעגלים של המוח הקטן.
Abstract
ארכיטקטורת הסלולר חזר היטב הבין של המוח הקטן לעשות את זה במערכת מודל אידיאלי לחקר הטופוגרפיה המוח. בבסיס cytoarchitecture אחידה יחסית הוא מערך מורכב של תחומים parasagittal של גנים ביטוי החלבון. מידור המולקולרי של המוח הקטן ניצבת ארגון אנטומי ופונקציונלי של סיבים מביא. כדי להעריך במלואה את המורכבות של הארגון cerebellar מיקדנו בעבר הגישה מכתים wholemount לניתוח קצב העברת נתונים גבוה של מומים דפוסים במוח הקטן העכבר. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את ריאגנטים, כלים וצעדים מעשיים מועילים בהצלחה לחשוף דפוסי ביטוי חלבונים במוח הקטן העכבר למבוגרים באמצעות immunostaining wholemount. הצעדים מודגשת כאן להדגים את התועלת של שיטה זו באמצעות ביטוי zebrinII / aldolaseC כדוגמה כיצד הטופוגרפיה קנס של המוח יכול להתגלות שלהקונפורמציה יליד תלת מימדי. מתואר גם הם עיבודים לפרוטוקול המאפשרים הדמיה של ביטוי החלבון תחזיות מביא ו cerebella גדול של מחקרים השוואתיים של הטופוגרפיה מולקולרית. כדי להמחיש יישומים אלה, נתוני מכתים מביא של המוח הקטן עכברוש כלולים.
Protocol
1. בעלי חיים זלוף ו Dissection המוח הקטן בהתאם חלבון, זלוף עשוי להיות חיוני מכתים 1,2 מוצלח. זלוף Transcardiac היא פולשנית, לא הישרדות הליך הדורש שימוש נכון של חומרי הרדמה. הכשרה נכונה, אישור מוסדי, ואישור IACUC כל הדרוש לפני שתנס…
Discussion
תיארנו את הפרטים הטכניים הדרושים מכתים wholemount מוצלח באמצעות גישה immunohistochemical תכליתי עבור ביטוי חושפני חלבון במוח המתפתח ומבוגרים. על ידי שימוש בגישה זו, מורכבים דפוסי הביטוי מולקולרית ניתן לנתח והטופוגרפיה המוח מוערך ללא צורך מייגעים זמן רב נהלים חתך רקמות.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מ"א נתמך על ידי החוקר חדש הזנק כספים אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה של הישיבה יוניברסיטי.
Materials
| Materials | Function in protocol |
| Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2) | Allows for consistent and slow perfusion. |
| Sharp-tip Scissors (FST/14081-08) | General use in perfusion and dissection. |
| Blunt-tip Forceps (FST/91100-12) | To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle. |
| Forceps (FST by Dumont AA/11210-10) | For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection. |
| Nutator (Fisher Scientific) | Used to keep tissue in motion during incubation periods. |
| 1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube) | All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion. |
| Perforated spoon (FST/10370-17) | Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution. |
| Leica MZ16 FA microscope | Used to examine wholemount staining. |
| Leica DFC3000 FX camera | Used to capture wholemount images. |
Table 1.
| Example calendar for a typical wholemount experiment | ||||||||
| Day 1 | Dent’s fix, room temperature, 8 hrs | Dent’s bleach, 4°C, overnight | ||||||
| Day 2 | 100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each | 100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min |
100% MeOH, -80°C, overnight | |||||
| Day 3 | 50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min | 15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min | 100% PBS, room temperature, 60-90 min | 10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min | 100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each | PMT, 4°C, overnight | ||
| Day 4-5 | PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs | |||||||
| Day 6 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex) | ||||||
| Day 7 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PBT, room temperature, 2 hrs | Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized | |||||
Table 2.
| Recipes (*=prepare fresh every time) | |
| PBS (phosphate buffered saline) | 0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417) |
| PFA (Paraformaldehyde) | Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353) |
| Dent’s Fixative3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) |
| Dent’s Bleach3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide |
| Enzymatic Digestion | 10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS. |
| PBST | PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.) |
| PMT25* | PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| PBT25* | PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| DAB* | Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction). |
| ABC Complex Solution | Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000) |
Table 3.
References
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
- Kim, S. -. H., Che, P., Chung, S. -. H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2006).
- Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development. 105, 61-74 (1989).
- Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri. J. Anat. 204, 257-269 (2004).
- Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).
- Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).
- Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum. Cerebellum. 10, 409-421 (2011).
- Larouche, M., Hawkes, R. From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation. Cerebellum. 5, 77-88 (2006).
- Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development. J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).
- Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis. Development. 138, 1207-1216 (2011).
- Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse. Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).
- Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry. Brain Res. 1222, 106-117 (2008).
- Marzban, H., Hawkes, R. On the architecture of the posterior zone of the cerebellum. Cerebellum. 10, 422-434 (2011).
- Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum. J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).
- Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4. J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).
- Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease. J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).
- Sarna, J. R., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse. Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).
- El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis. Development. 135, 2981-2991 (2008).
- Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).
- Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest. Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2. Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).
- Davis, C. A. Whole-mount immunohistochemistry. Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).
Tags
Wholemount ImmunohistochemistryBrain TopographyCerebellumCellular ArchitectureGene Expression DomainsProtein Expression DomainsMolecular CompartmentalizationAfferent FibersPatterning DefectsMouse CerebellumWholemount Staining ApproachProtein Expression PatternsZebrinII/aldolaseC ExpressionThree-dimensional ConformationAfferent ProjectionsComparative StudiesMolecular TopographyRat Cerebellum
Cite This Article
White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography. J. Vis. Exp. (62), e4042, doi:10.3791/4042 (2012).