Полу-количественный подход к оценке биопленки использование морщинистой развития колонии
Summary
Мы предлагаем простые, полу-количественный метод для исследования биопленки<em> В пробирке</em>. Этот метод использует Zeiss Stemi 2000-C Анатомический микроскоп (с камерой приложение) для мониторинга сроков и структуры биопленки, по оценке развития морщинистые колонии.
Abstract
Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This ‘spotted culture’ technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.
Protocol
Discussion
В этой работе мы описываем полуколичественного метода оценки биопленки использованием V. fischeri в качестве модельного организма. В частности, мы используем рассечения микроскоп с камерой крепление для контроля формирования биопленок и развития, морщинистой формирования колонии в течение долгого времени на твердой поверхности агара. В этом протоколе, мы выделяем два конкретных типов методов, которые мы обычно используем для оценки морщинистое образование колонии. Первым из них является конечной точкой анализа, который позволяет наблюдать в финал, общий 3D архитектуру, рисунка, и диаметр культуры пятнистый на выбранный «окончательные» момент времени. Такой подход является наиболее полезным для оценки мутантных штаммов или условия, которые приводят к резкому дефектами в формирование биопленок. Однако такой подход не делает различия между более тонкие различия, происходящие в моменты времени до выбранной конечной точки. Для более внимательно следить за морщинистой формирование колоний, мы используем анализ времени, конечно, что позволяет определить начало шrinkled образование колоний и следить за ее развитием с течением времени. В результате такого подхода, более тонкие различия в сроках морщинистое образование колонии, 3D архитектуру, и структурирование может быть идентифицирован. Мы использовали этот анализ раз курс для создания двух полуколичественного анализов формирование биопленок. Во-первых, время, когда напряжение начинает развиваться 3D-архитектура может быть по сравнению с контролем напряжения. Мы нашли, что задержка с формированием биопленки конкретного мутанта на тех же условиях достаточно последовательно 9. Например, в данные, приведенные на рис. 2 мутанта постоянно выставляются около 4 часов задержки начала формирование биопленок. Второй полуфинал количественная мера биопленки является изменение размера диаметра морщинистые колонии (спот). Мы обнаружили, что диаметр морщинистые колонии постепенно отличается от не-биопленки колонии, достигнув 2-кратную разницу в точке время окончания (рис. 3 </сильный>) (Morris и Visick, неопубликованные данные). На сегодняшний день мы не наблюдал один фенотип без другого (например, образование биопленки без увеличения диаметра колонии) (неопубликованные данные), хотя и остается возможной некоторые мутанты будут вести себя по-разному. Действительно, было сообщено, для В. холерных, что некоторые морщинистой результате колоний в значительном увеличении в колонии диаметром в то время как другие этого не делают 15. Тем не менее, оценивая изменения в диаметре, с течением времени может помочь в характеристике потенциальных мутантов биопленки и / или предоставить дополнительную количественную меру мутантов с задержками в развитии. Из этих двух мер биопленки (время и диаметр), определения начала морщинистое образование колоний является более чувствительным, но и более субъективным, чем определения диаметра пятна. Тем не менее, обе эти меры обеспечивают полу-количественной оценки фенотипа, что является чрезвычайно полезным для исследователей биопленки, но не легко поддаются quantificatioл.
При выполнении заметил культурный анализов, важно принять во внимание экологические условия, в которых замечены штаммов культивируют. Морщинистой формирование колоний, часто под влиянием различных условий окружающей среды, в том числе наличие питательных веществ, температура и влажность. Для уменьшения изменчивости между экспериментами, это полезно для стандартизации этих условий, как много можно (т.е. стандартизации агаром в заданном объеме и культивирования штаммов замечены при контролируемой температуре). Для дальнейшего контроля за изменчивостью между пятен экспериментов, важно включить соответствующие штаммы контроля в каждой серии экспериментов. Наконец, при интерпретации данных этих исследований, необходимо выполнить любой эксперимент несколько раз (3 +), особенно при оценке тонкие различия в морщинистое образование колоний (например, задержка в формировании биопленок или рисунок, различия). Некоторые ограничения этого протокола являются: 1) определяющиеING ли клетки имеют дефект роста может быть трудно: рост клеток в культуральной жидкости могут не точно отражать темпы роста на твердых средах, а также точного определения роста биопленки формирования клеток, которые могут держаться вместе, не всегда возможно; 2) деформации с ростом дефектов будет проблематично для анализа, 3) он не может быть можно выделить диаметр различия между штаммами с тонкими фенотипов биопленки, 4) для штаммов, которые не растут в концентрические кольца, не всегда возможно точно измерить изменения в диаметре, 5), а паттерны можно наблюдать во время формирование биопленок, нет никакого способа для количественного определения паттерна в результате биопленки и 6) нет способа измерить Z-размерности биопленки с этой экспериментальной установки . Несмотря на эти ограничения, тем не менее, этот протокол предоставляет возможность получить численные данные, чтобы помочь в оценке морщинистое образование колонии.
В этом протоколе, мы используем специальный изображенийсистемы (например, Zeiss рассечения микроскопа и Progres CapturePro изображений программное обеспечение), чтобы наблюдать и оценивать морщинистое образование колонии. Системы визуализации, описанные здесь является мощным: способность обнаруживать начало морщинистое образование колонии, и таким образом оценивать развитие с подхода, конечно время значительно усиливается с помощью рассечения микроскопом. Однако, если эта технология отсутствует, протокол может быть адаптирован для использования с другим оборудованием, в том числе простой цифровой фотоаппарат с зум-фокус. Хотя этот протокол сосредоточен на оценке морщинистой развитие колонии, она также может быть изменен, чтобы оценить пленка образование, форма биопленки, которая развивается, когда клетки растут статически в культуральной жидкости. Этот протокол также может оказаться полезной при оценке других показателей формирование биопленок, в том числе включение конкретных красителей в колонии пятнистых процессе развития биопленки. Они включают, но не ограничиваются, красители, такие как Конго красный и calcofluили которые могут связываться с целлюлозой, общие компоненты бактериальных биопленок 16. Кроме того, этот протокол, хотя и разработана для использования совместно с В. fischeri, не ограничивается этим организмом, но может быть обобщен на изучение биопленки во многих различных организмов, таких как Сенная палочка 4, холерный вибрион 5, Vibrio parahaemolyticus 6 и синегнойной палочки 7, все выставки морщинистое образование колонии. Наконец, он также может быть адаптирована для изучения морфологии других колоний, которые имеют с развитием картины, такие, как, возможно, паттерн, который происходит в процессе роста Myxococcus Ксанф 17 и воздушный развитие структуры синегнойной палочки 18. Этот протокол, таким образом, общего пользования в области микробиологии и биопленки исследователей.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом R01 NHI GM59690 присуждена KLV.
Materials
| Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Zeiss | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
| ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
| CL 1500 EC Cold Light Source | Zeiss | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
| ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
| Image J | NIH | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |
References
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20 (2005).
- Branda, S. S. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).
- Beyhan, S. Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR. J. Bacteriol. 189, 388 (2007).
- Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus. Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).
- Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function. J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).
- Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri. Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).
- Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri. Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).
- Nyholm, S. V. Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).
- Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and σ54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri. Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).
- Mandel, M. J. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215 (2009).
- Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri. J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).
- Geszvain, K., Visick, K. L. The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri. J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).
- Krasteva, P. V. Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP. Science. 327, 866 (2010).
- Romling, U. Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae. Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).
- Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus. J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).
- Lee, K., Veeranagouda, Y. Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures. Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).
