Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım

1. İlk Karakterizasyonu ve Düşünceler Biyofilm oluşumu genellikle hücre yoğunluğu ve büyüme hızı etkilenir. Bu nedenle, büyüme oranı (zamanla optik yoğunluk (OD) artış) ve basit bir büyüme eğrisi ve hücre kaplama deneyler gerçekleştirilerek ilgi suşu (ler) in verimi (nihai hücre sayısı) belirlenmesi gereklidir. Deneyler lekelenme sonuçları yorumlanırken büyüme, veya OD ve hücre sayısı arasında korelasyon eksikliği hataları dikkate alınmalıdır. Küçük plaka-to-plaka değişimi biyofilm gelişimi etkileyebilecek gibi, buruşuk koloni oluşumu değerlendirirken aynı plaka üzerinde uygun pozitif ve negatif kontrolleri ekleyin. Tespit için en iyi koşulları, yani kontrol ve ilgi mutant (lar) arasındaki en belirgin farklılıklar ortaya olanları belirleyin. Gibi farklı medya ya da sıcaklık gibi çeşitli koşullar altında sıvı kültür suşları büyümek ve farklı sahneönce lekelenme büyüme (üstel veya sabit faz) s. Nokta 10 uygun ortam üzerine çeşitli hücre yoğunluklarında kültür ul ve koloni morfolojileri belirgin hale gelene kadar istenilen sıcaklıkta inkübe edin. Son nokta testi (yani 48 saat) tespit sonra önceden belirlenmiş bir zaman noktasında kırışmış koloni gelişimi değerlendirmeyi içerir. Bu değerlendirme suşlar için yararlıdır biyofilm sergileniyor (ya da sergilemek için önerilmektedir) ciddi kusurlar. Zaman elbette testi bir süre (yani, her saat) sonrası lekelenme üzerinde kırışmış koloni oluşumu değerlendirir. Bu testte bir süre boyunca buruşuk koloni oluşumu ve kalıp gelişme başlangıç ​​belirlenmesi izin vererek biyofilm bir yarı-niceliksel izin verir. Belirli bir zaman ders için toplama noktaları deney ve sayısı süresi ön deneylerde tespit edilmelidir. Kolayca ayarlanır, sonrası lekelenme zaman izlemek içinkadar saymak için imer. 2. V. yılında Buruşuk Koloni Morfolojisi Mikroskopik Değerlendirme fischeri Inoküle V. LB-Tuz (LBS) orta 13 (1% [w / v] tripton,% 0.5 [w / v] maya ekstresi,% 2 [w / v] sodyum klorid, 50 mM Tris-HCl [5 ml içine fischeri hücreleri pH 7.5]) 28 gece, titreme ile gerekli antibiyotik ve inkübe içeren ° C Hücreleri istenilen OD 600 ulaşana kadar Sabah, aynı koşullar altında taze LBS orta ve inkübe 5 ml içine bir 1:100 ile hücreleri altkültürü (örneğin, OD 600 = 0.2 veya 0.5). Bir mikrofüj tüpü ve bir dakika maksimum hızda bir mikrofüj setindeki santrifüj içinde kültür pipetle 1 ml. Aspirasyon ile süpernatantı. Steril% 70 yapay deniz suyu 1 ml (ASW) (35 mM MgSO 4-7H 2 O, 7 mM CaCl yılında pelet resuspending tarafından artık medya ve ekstrasellüler bileşenleri kaldırmak için hücreleri yıkayın2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) ve santrifüjleme tekrarlayarak. % 70 ASW 1 ml yıkanmış pelletini. Her örnek olarak 600 nm'de OD tarafından tahmin hücrelerin, aynı sayıda içerdiğinden emin olun. Ek% 70 ASW ile daha konsantre örnekleri seyreltilmesiyle Gerekli ayarlamaları yapın. Ön deneylerde, çeşitli başlangıç ​​OD değerlerini azından nokta kültürler suşları veya koşullarının, belirli bir küme için en uygun başlangıç ​​OD belirlenmesi. En iyi sonuçlar elde edilmiştir V. noktalar yaklaşık 0.2 bir OD ile kültürler üretilir fischeri. Gerekli antibiyotik içeren LBS plakaları üzerine yıkanmış hücrelerin 10 ul nokta. Bir tabağa bir kültür lekelenme olduğunda, sadece agar yüzeyinden sabit pipet (parmağınızla) emin olun. Olmayan bir açı, dikey nokta ve spot tekdüze dağılım için yavaş yavaş sıvı çıkarır. Genellikle her bir suş (plaka başına kadar 6 lekeler) plaka başına bir kez fark edilir, espriDeneme başına h birden plakaları (2-3). Benekli kültür eşit dağıtılmış kalmasını sağlamak için, nokta inkübatöre plaka geçmeden önce kurumasını bekleyin. Plakalar ters çevirin ve 28 de bunları tasarlamak ° C Aşılanmasını takiben 12-15 saat büyüyen nokta saatlik başından morfolojisi izleyin. Biz bir kamera eki (Progres C10 PLUS) ve Progres CapturePro ve gözlemlemek ve belgelemek koloni morfolojisi ve kırışmış koloni oluşumunun başlangıcında ve ilerleyişini değerlendirmek üzere ImageJ yazılım programları ile bir diseksiyon kapsamı (Zeiss STEMI 2000-C) kullanın. Görüntü yukarıdan yakalanır ise adım 2.5 listelenen özel kurulum için, lekeler, bir CL 1500 EC soğuk ışık kaynağı ile şeffaf bir cam aşamasında altından aydınlatılmıştır. Bu kurulum görüntüleme kırışmış koloni gelişimi için, çünkü V. uygunudur fischeri koloniler (noktalar) saydam vardır. St listelenen spesifik ekipman yokluğundaep 2.5, tam koloni izlenmesine olanak verir ve ayarlanabilir ışık kaynağı ve ideal olarak, ekli bir kamera olan herhangi bir mikroskop kullanarak monitör buruşuk koloni morfolojisi. Eğer gerekirse, bir dijital kamera da ekli bir kameranın yokluğunda kullanılmıştır, ancak bu optimal değildir edilebilir. En buruşuk koloni gelişimi görselleştirme, bunun geliştirilmesi biyofilmlerin üç boyutlu şekil ayırt edilebilir olduğu gibi bakteriyel koloniler altında ışık yansıma yoğunluğu açısı ve hem de ayarlamak için gereklidir. Benekli koloni ve koloni mimarisi (kırışıklık) açıkça ayırt olduğu gibi çevreleyen agar arkaplan arasında güçlü kontrast sağlamak optimum aydınlatma koşulları belirler. Koloni renk değişiklikleri biyofilm oluşumu sırasında oluşabilir gibi bazı durumlarda, benekli koloni rengi de dikkate alınmalıdır. Ortaya çıkarmak için ışık kaynağının şiddeti ve açısını ayarlayınrenklenmesi bu ince değişiklikler. Uygun ayarları elde edilir sonra, deneme süresi boyunca onları korumak. Ne kadar süre geçtiğini inokülasyon zaman buruşmuş koloni gelişimi her tür ya da durum için başlatır hangi zaman unutmayın. Modelleme ve 3B yapıların formasyonu (yani, çizgiler oluşturan dış kenarında veya 'dalgaların' merkezi meydana gelen) ilk açıktır hangi bir zaman noktası olarak buruşuk koloni oluşumunun başlangıç ​​tanımlayabilir. Mutant hücreler koloni buruşuk oluşumunun başlangıç ​​(örn., Şek. 2) için zaman azaldığı ya da artan rastlamak mümkündür. Uygun dijital fotoğraf çekimi ile buruşmuş koloni oluşumunun başlangıcında ve geliştirme belgeleyin. Bu deney boyunca görüntü alırken aynı büyütme kullanmak önemlidir. Mikroskobun Mercekten kameranın arkasında bulunan kolu kullanarak bilgisayar ekranına görünümüne geçin. Mercek arasında geçiş yaparkenve bilgisayar ekranında görüntüleme, görünümünü ayarlamak ve buna odaklanmak. Görüntüleme benekli kültürler önce, Petri plakasının kapak tipik olarak net görüntü sunmak için çıkarılır. Benekli kültür adımları 2.5 ve 2.6 özetlenen kurulum kullanarak kapaktan imaged olabilir Ancak, bu isteğe bağlı bir adımdır. Buruşuk koloni oluşumunun başlangıcında izleyerek her zaman noktasında, buruşuk koloni gelişme desen unutmayın. Mimarisi içten dışa gelişebilir veya Bu değerlendirme inç dışında farklı suşları veya farklı koşullar altında oluşmuş biyofilm ayırt etmek için bir mekanizma sağlar. Her bir zaman noktasında gelişmekte koloninin çapı ölçün. Bu elle yapılması veya dijital olarak ilgili yazılım programı kullanılarak yapılabilir. Dijital yapılırsa, Progres CapturePro programı kullanmak ve ilk deneyde kullanılan özel büyütme için ölçekleme çubuğu kalibre. Çekilen her görüntü ölçek bar bulunmaktadır. ImageJ yazılım programı kullanarak koloni çapı hesaplamak için, her resim dosyasını açın. Aşağıdaki gibi ölçek çubuğu standartlaştırın: araç çubuğundan "Düz çizgi seçeneğini" seçin. Aynı uzunluk ve genişlik düz bir çizgi ile gömülü ölçek çubuğu Yerleşimi. Etiketli sekmesinden "Set Ölçeği" Seç "analiz edin." Ve "Tamam" seçeneğini seçin; "bilinen mesafe" kutusunda, (yani, 2 mm olarak orijinal ölçekte çubuğundan belirlenir) karşılık gelen uzunluğu yerleştirin. Nokta arasında yatay bir çizgi eklemek için "Düz çizgi" seçeneğini kullanın. Çözümle sekmesi altında, "Tedbir" seçeneğini seçin. Yeni Sonuçlar penceresinde, hesaplanan uzunluğu sağlanacaktır. Nokta arasında bir dik çizgi ekleyerek ikinci bir ölçüm alın. Çapı yeniden hesaplamak. Iki ölçümün ortalama kaydedin. Grafik Excel gibi bir yazılım programı kullanarak her noktada, her nokta için ortalama çapı. Deneyin sonunda ya da belirli bir zaman noktasında ya da herhangi bir başka olduğunu ortaya çıkarbiyofilm gelişmesi. Sonuna ulaşıldığında, bu Powerpoint gibi bir yazılım programı kullanarak zamanla deseni geliştirme görselleştirmek için bir rakam (lar) içine görüntüleri birleştirmek. 3. Temsilcisi Sonuçlar Bu deneylerde kullandığımız V. sağlam bir agar yüzeyinde kırışık kolonilerin gelişimi değerlendirerek biyofilm oluşumu incelemek için bir model organizma olarak fischeri. V. Biyofilm üreten suşlar 40 saat içinde kapsamlı 3D mimarisi ile fischeri formu koloniler (Şekil 1) 8,9,14. Bir süre boyunca bakıldığında, kontrol suşu tarafından kırışmış koloni oluşumu yaklaşık 12 kadar erken başlatır belirginleşir saat sonrası aşılama (özel koşullarına bağlı olarak) (Şekil 2) 9. Buna karşılık, bir temsilci mutant tarafından biyofilm oluşumu yaklaşık 16 saat sonrasında aşılama 9 kadar başlatarak değil, yaklaşık 4 saat geciktirilir. Aktarım istasyonlarıBu deneylerin ts 9 Bu değerlendirme yarı kantitatif hale zamanlaması nispeten tutarlı olduğunu ileri sürdü. Biyofilm ikinci bir yarı-nicel ölçü zaman içinde gelişen koloninin çapı değişim kullanımını sağlar. Şek. 3A, temsili bir biyofilm-yetkili suşu koloniler oluşturduğunu karmaşıklığı ve biyofilm oluşturan olmayan bir temsilcisi zorlanma göre çapı artar. Bu iki suş oluşturduğu kolonilerin çapları zaman içinde dikkatli ölçümler, biyofilm-yetkili kolonilerin boyutu biyofilm-negatif koloniler daha büyük oranda arttığını ortaya çıkardı ve bitiş saatini noktada iki neredeyse 2 kat farklılık – kat (Şekil 3B). Bir temsili geç zaman ya da "son nokta" koloni morfolojisinin görüntü sık literatürde gösterilmiştir rağmen Böylece, ek, yarı-nicel veri biyofilm kusurun daha iyi anlaşılması izin verecek bir toplanabilir. Şekil 1. Son-nokta tayini. Bu rakam V. temsilcisi (sağ) non-biyofilm oluşturan (solda) ve biyofilm oluşturan suşlar kullanarak bir son nokta tayinin bir örnektir fischeri. Bu görüntüleri 40 saat post-lekelenme toplanmıştır. Bu görüntüler, vahşi tip V ile üretildi fischeri vektör kontrol (non-biyofilm oluşum) veya set Morris ve ark., 2011 için toplanan verilerin bir RSCS aşırı plazmid (biyofilm oluşturan) ve idi kısmını içeren. Şekil 2. Zaman kurs testi. Üst panelde bir biyofilm-yetkili kontrolü suşu tarafından biyofilm temsilcisi görüntüleri içerir V. Seçilen bir zaman boyunca fischeri. Biyofilm oluşumunun başlatılması 12 saat belirgindir. Alt panel temsilcisi i içerirV. bir mutant mageler biyofilm 16 saat sonrası aşılama de başlatılması ile zamanla kırışmış koloni oluşumunun başlangıcında bir gecikme (4 saat), sergiler fischeri. Bu ırklar arasındaki ince farkları sadece erken zaman noktalarında tespit edilirken 40 saat suşları, biyofilm oluşumunun yoğunluğu ve desenleme benzer unutmayın. Bu görüntüler RSCS aşırı wild-tip ve sypE mutant ile oluşturulan V. fischeri hücreleri ve veri vardı parçası Morris ve ark için toplanan seti., 2011. Biyofilm oluşumunun bir yarı-nicel analizi Şekil 3. Koloni çapı. V. temsilcisi biyofilm oluşturan (üst panel) ve non-biyofilm oluşturan (alt panel) suşları tarafından biyofilm oluşumu (A) Zaman kurs fischeri. Biyofilm oluşturan gerginlik büyük bir artış sergileyen unutmayınolmayan biyofilm oluşturan suşu göre zamanla çapı. Bu görüntüler, vahşi tip V ile üretildi bir veri RSCS aşırı plazmid (biyofilm oluşturucu) ya da bir vektör kontrol (non-biyofilm oluşturucu) ve edildi parçası içeren fischeri Morris ve ark., 2011 için toplanmıştır ayarlanır. (B) protokolü belirtildiği gibi bu veriler ImageJ ve Excel yazılımı kullanılarak elde edilmiştir paneli A'da iki suşu tarafından zamanla koloni çapı artış bir grafik gösterimidir.