גישה חצי כמותי להערכת גיבוש biofilm באמצעות פיתוח המושבה מקומט

1. אפיון ראשוני ושיקולים היווצרות biofilm מושפע בדרך כלל על ידי צפיפות התאים ואת קצב הצמיחה. לכן, יש צורך לקבוע את שיעור הצמיחה (גידול צפיפות אופטית (OD) לאורך זמן) תשואה (מספר התא האחרון) של זן (ים) של עניין על ידי ביצוע עקומת הצמיחה פשוט ציפוי מבחני התא. פגמים הצמיחה, או חוסר התאמה בין OD ומספר התא, יש לקחת בחשבון בעת ​​פירוש תוצאות תצפית ניסויים. כלול את הפקדים חיוביות ושליליות מתאימות על אותה צלחת כאשר מעריכים הקמת המושבה מקומט, כמו וריאציה קלה הצלחת אל צלחת עשויה להשפיע על התפתחות biofilm. לזהות את התנאים הטובים ביותר לאיתור, כלומר, אלה לחשוף את הבדלים ברורים ביותר בין שליטה לבין מוטציה (ים) של עניין. לגדל זנים בתרבות נוזל בתנאים שונים, כמו מדיה או טמפרטורות שונות, לשלב אחרים של צמיחה (שלב מעריכי או נייח) לפני כתמים. במקום 10 μl של התרבות על צפיפות תאים שונים על גבי מדיה מתאים, דגירה בטמפרטורה הרצויה עד מורפולוגיות המושבה לעין. Assay סוף נקודות כולל הערכה של הקמת המושבה מקומט בנקודת זמן קבועה מראש לאחר תצפית (כלומר, 48 שעות). הערכה זו שימושית עבור זנים (או מוצעים להציג) התערוכה פגמים חמורים במבנה biofilm. Assay כמובן זמן מעריך הקמת המושבה מקומט על פני תקופה של זמן (כלומר, כל שעה) לאחר כתמים. Assay זה מאפשר הערכה כמותית למחצה של היווצרות biofilm בכך שהוא מאפשר לקבוע את תחילת היווצרות קמטים המושבה ופיתוח הדפוס על פני תקופה של זמן. משך הניסוי ואת מספר נקודות איסוף לקורס זמן נתון יש לקבוע בניסויים ראשוניים. כדי לעקוב בקלות אחר הזמן שלאחר איתור, נקבע עלimer לספור עד. 2. הערכה מיקרוסקופית של מורפולוגיה המושבה מקומט ב V. fischeri מחסן ו ' fischeri התאים לתוך 5 מ"ל של מלח-LB (LBS) בינוני 13 (1% [w / v] tryptone, 0.5% [w / v] תמצית שמרים, 2% [w / v] נתרן כלורי, 50 מ"מ טריס-HCl [ pH 7.5]) המכיל את כל אנטיביוטיקה הדרושים דגירה, עם רעד, בן לילה ב 28 ° C. בבוקר, תת התאים עם דילול 1:100 לתוך 5 מ"ל של מדיום LBS דגירה טרי באותם תנאים עד שהתאים הגיעו OD 600 הרצוי (למשל, OD 600 = 0.2 או 0.5). פיפטה 1 מ"ל של תרבות לתוך צינור microfuge ו צנטריפוגות בקבוצת microfuge במהירות המרבית למשך דקה אחת. הסר את supernatant ידי שאיפה. שוטפים את התאים להסיר התקשורת שיורית ורכיבים תאיים על ידי resuspending גלולה ב 1 מ"ל של מי ים סטריליים מלאכותיים 70% (ASW) (35 מ"מ MgSO 4-7H 2 O, 7 mM CaCl2-2H 2 O, 210 מ"מ NaCl, KCl mM 7) וחזרה על צנטריפוגה. Resuspend גלולה שטוף ב 1 מ"ל של ASW 70%. ודא כי מדגם זה מכיל את אותו מספר של תאים כפי שנאמדה ב -600 ננומטר ידי OD. בצע את ההתאמות הנדרשות על ידי דילול דגימות מרוכז יותר ASW 70% נוספים. בניסויים ראשוניים, תרבויות ספוט בבית הראשונים ערכים שונים כדי לקבוע OD OD החל האופטימלי עבור קבוצה נתונה של זנים או תנאים. התוצאות הטובות ביותר ניתנות על ידי ו ' fischeri כאשר נוצרות נקודות מתרבויות עם OD של כ 0.2. ספוט 10 μl של תאים שטף על גבי צלחות המכילות ק"ג כל אנטיביוטיקה הדרושים. כאשר איתור תרבות לצלחת, הקפד פיפטה יציב (עם האצבע) מעל פני השטח אגר. לאתר אנכית, לא בזווית, ועל להוציא את הנוזל לאט התפלגות אחידה של המקום. בדרך כלל כל זן הוא הבחין פעם אחת בכל צלחת (עד 6 נקודות לכל צלחת), שנינותש הצלחות מרובות (2-3) בכל ניסוי. כדי להבטיח את התרבות הבחין עדיין מופץ באופן שווה, במקום לאפשר לו להתייבש לפני שעבר את הצלחת אל האינקובטור. הפוך את הצלחות דגירה אותם 28 ° C. לפקח על המורפולוגיה של תחילת מקום גדל והולך מדי שעה בשעה 12-15 שעות לאחר חיסון. אנו משתמשים היקף לנתח (STEMI Zeiss 2000-C) עם קובץ מצורף המצלמה (הקידמה C10 PLUS) ו CapturePro הקידמה ותוכניות ImageJ תוכנה לצפות ולתעד מורפולוגיה המושבה כדי להעריך את התקדמות התחלה של היווצרות המושבה מקומט. להתקנה ספציפית המצוינים בשלב 2.5, כתמים מוארים מלמטה ועד לשלב זכוכית שקוף עם מקור אור EC 1500 CL קר, בעוד תמונות נלכדים מלמעלה. התקנה זו היא אופטימלית לפיתוח המושבה הדמיה מקומט כי V. fischeri המושבות (כתמים) הם שקופים. בהיעדר ציוד מסוים מופיע רחובEP 2.5, מורפולוגיה צג המושבה קמטים באמצעות כל מיקרוסקופ לנתח המאפשרת צפייה במושבה מלא ויש לו מקור אור מתכווננת, באופן אידיאלי, המצלמה המצורפת. במידת הצורך, מצלמה דיגיטלית יכול גם להיות מנוצל בהעדר המצלמה המצורפת, אבל זה לא אופטימלי. הטובה ביותר לחזות התפתחות המושבה מקומט, יש צורך להתאים גם את עוצמת התאורה והזווית של השתקפות מתחת מושבות חיידקים כאלה, מורפולוגיה תלת מימדי של biofilms מתפתחות ניתן להבחין. לקבוע את תנאי תאורה אופטימליים המספקים את הניגוד החזק בין המושבה הבחינו והרקע אגר שמסביב, כך לאדריכלות (קמטים) של המושבה הוא להבחין בבירור. במקרים מסוימים, הצבע של המושבה הבחין חייבים גם לקחת בחשבון, כמו שינויים בצבע המושבה יכולה להתרחש במהלך היווצרות biofilm. כוון את העוצמה ואת הזווית של מקור התאורה לחשוףאלה שינויים עדינים צבע. פעם אחת את ההגדרות המתאימות מושגות, לשמור אותם במשך כל הניסוי. שים לב כמה זמן עובר מרגע של חיסון לזמן שבו הקמת המושבה מקומט יוזם על זן אחד או מצב. להגדיר את תחילת היווצרות קמטים המושבה כנקודת הזמן שבה היווצרות דפוסים ומבנים 3D (כלומר, יוצרים פסי בקצה החיצוני או "אדוות" המתרחשים במרכז) ניכר 1. התאים שעברו מוטציה, עשויות להציג ירידה או עלייה הזמן להתחיל של היווצרות המושבה מקומט (למשל, איור. 2). לתעד את תחילת הפיתוח של היווצרות קמטים המושבה על ידי לכידת תמונות דיגיטליות המתאימים. חשוב להשתמש בהגדלה אותה בעת איסוף תמונות לאורך כל הניסוי. לעבור את הנוף העינית של המיקרוסקופ למסך המחשב באמצעות מנוף הממוקם בצד האחורי של המצלמה. בעת מעבר בין העיניתומסך צפייה המחשב, להתאים את התצוגה ולמקד בהתאם. לפני תרבויות הדמיה מנוקדים, מכסה של צלחת פטרי מוסר בדרך כלל כדי לספק את התמונה הברורה. עם זאת, זה צעד לא חובה, כמו תרבויות מנוקדים ניתן הדמיה באמצעות המכסה באמצעות ההתקנה המפורט צעדים 2.5 ו -2.6. בכל נקודת זמן לאחר תחילת היווצרות המושבה מקומט לציין את דפוס התפתחות המושבה מקומט. ארכיטקטורת עלולים לפתח מחוץ פנימה, או מחוץ פנימה הערכה זו מספקת מנגנון להבחין בין biofilms שהוקמה על ידי זנים שונים או בתנאים שונים. מדוד את הקוטר של המושבה המתפתחת בכל נקודת זמן. ניתן לעשות זאת באופן ידני, או באופן דיגיטלי באמצעות התוכנה המשויך. אם נעשה באופן דיגיטלי, השתמש בתוכנית CapturePro הקידמה תוכנה 1 לכייל את סרגל קנה המידה כדי הגדלה המסוים של הניסוי. כלול את סרגל קנה המידה של התמונה בכל בשבי. כדי לחשב את קוטר המושבה באמצעות תוכנה ImageJ, לפתוח כל קובץ תמונה. לתקנן את סרגל קנה המידה באופן הבא: בחר את "אפשרות קו ישר" מסרגל הכלים. שכבת בר בקנה מידה מוטבע עם קו ישר באורך ורוחב אותו. בחר "סולם הגדר" מהכרטיסייה שכותרתו "ניתוח". בתיבת "ידוע המרחק", הכנס את אורך המתאים (כפי שנקבע משורת בהיקף המקורי, כלומר, 2 מ"מ) ולחצו על "אישור". השתמש "קו ישר" אפשרות להוסיף קו אופקי על פני המקום. תחת הלשונית ניתוח, בחר "מדוד". בחלון התוצאות החדשות, אורך מחושב יסופק. להשיג מידה 2 על ידי הוספת קו אנכי על פני המקום. מחדש לחשב את קוטרו. רשום את הממוצע של שתי המדידות. גרף הקוטר הממוצע על כל מקום בכל נקודת זמן באמצעות תוכנה כגון Excel. בסופו של הניסוי מתרחש גם בנקודה זמן מוגדר או כאשר אין עודהפיתוח של biofilm. לאחר סוף הוא הגיע, לאחד את התמונות לתוך הדמות (ים) כדי לחזות את התפתחות הדפוס לאורך זמן באמצעות תוכנה כגון Powerpoint. 3. נציג תוצאות בניסויים אלה השתמשנו V. fischeri כאורגניזם מודל ללמוד היווצרות biofilm ידי הערכת התפתחות המושבות מקומט על פני אגר מוצק. Biofilm, לייצר זנים של V. fischeri מושבות טופס עם ארכיטקטורת 3D נרחב בתוך 40 שעות (איור 1) 8,9,14. כאשר בחנו במשך הזמן, מתברר כי הקמת המושבה מקומט על ידי זן פקד מפעילה מוקדם ככל כ 12 שעות לאחר חיסון (בהתאם לתנאים מסוימים) (איור 2) 9. לעומת זאת, היווצרות biofilm ידי מוטציה נציג בהשהייה של כ 4 שעות, לא יוזם עד כ 16 שעות לאחר חיסון 9. RepeaTS של ניסויים אלה הראו כי העיתוי היה עקבי יחסית, מה שהופך את הערכה זו חצי כמותית 9. המדד השני חצי כמותית של היווצרות biofilm עושה שימוש שינוי בקוטר של המושבה המתפתחת עם הזמן. כפי שמוצג באיור. 3A, זן נציג biofilm-המוסמכת מהווה מושבות העלייה המורכבות בקוטר יחסית זן נציג שאינו ליצור biofilms. מדידות קפדניות לאורך זמן של קוטר של המושבות שהוקמה על ידי שני זנים עולה כי גודל biofilm-המוסמכות מושבות עלה בשיעור גדול יותר מאשר biofilm שלילי המושבות, ובשלב שעת סיום 2 שונה בכמעט 2 – פי (איור 3 ב). כך, אם כי תמונות של זמן מאוחר נציג או "סוף נקודות" מורפולוגיה המושבה לעיתים קרובות מוצגים בספרות, נוספים וכמותיות הנתונים ניתן לאסוף את זה יאפשר הבנה טובה יותר של פגם biofilm. באיור 1. סוף נקודות assay. נתון זה הוא דוגמה assay סוף נקודות באמצעות נציג שאינו biofilm יוצרי (משמאל) biofilm להרכיב (מימין) זנים של V. fischeri. התמונות הללו נאספו ב 40 שעות שלאחר כתמים. תמונות אלה נוצרו עם wild-type ו ' fischeri המכיל בקרת וקטור (לא biofilm יוצרי) או חלק overexpressing הוב"א פלסמיד (biofilm יוצרי) והיו הנתונים שנאספו להגדיר עבור מוריס et al., 2011. 2. איור זמן מנות assay. הפאנל העליון מכיל תמונות מייצגות של היווצרות biofilm ידי זן biofilm-המוסמכת השליטה V. fischeri במשך הזמן שבחרת. תחילת היווצרות biofilm ניכר על 12 שעות. הפאנל התחתון מכיל אני נציגהמגים של זן מוטנטי של V. fischeri שמספקת עיכוב (4 ג) ב תחילת היווצרות קמטים המושבה לאורך זמן, עם היווצרות biofilm ייזום ב 16 שעות לאחר חיסון. שים לב ב 40 שעות זנים נראים דומה בעוצמת ו דפוסים של היווצרות biofilm, בעוד הבדלים דקים בין זנים אלה הם נצפו רק בנקודות זמן קודמות. תמונות אלה נוצרו עם הוב"א overexpressing wild-type ו sypE מוטציה V. תאים fischeri וחלק היו של הנתונים שנאספו להגדיר עבור מוריס et al., 2011. 3. איור המושבה בקוטר כניתוח חצי כמותית של היווצרות biofilm. () זמן מהלך היווצרות biofilm על ידי נציג (הפאנל התחתון) זנים biofilm יוצרי (הפאנל העליון) ולא biofilm יוצרי של V. fischeri. שים לב כי המתח biofilm יוצרי מציג עלייה גדולה יותרבקוטר לאורך זמן ביחס למתח הלא biofilm להרכיב. תמונות אלה נוצרו עם wild-type ו ' fischeri המכיל חלק overexpressing הוב"א פלסמיד (biofilm יוצרי) או בקרת וקטור (לא biofilm יוצרי) והיו הנתונים שנאספו להגדיר עבור מוריס et al., 2011. (ב) ייצוג גרפי של גידול בקוטר של המושבה לאורך זמן על ידי שני זנים בלוח א 'אלה נתונים שנוצרו באמצעות התוכנה ImageJ ו-Excel כמתואר בפרוטוקול.