Summary

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Published: August 08, 2012
doi:

Summary

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

Abstract

הנויטרופילים הם סוג השכיח ביותר של תא דם לבן. הם מהווים חלק בלתי נפרד של מערכת החיסון המולדת 1. במהלך דלקת חריפה, הנויטרופילים הם תאים דלקתיים הראשונים לעבור באזור הפציעה. גיוס של נויטרופילים לאתר הפציעה הוא תהליך הדרגתי, הכולל התרחבות 1, של כלי הדם כדי להגביר את זרימת הדם, השנייה, שינויים מבניים כלי הדם ולברוח של חלבונים פלזמה מזרם הדם, 3, הדבקה מתגלגל, גלגול של נויטרופילים פני האנדותל, ו 4 הצטברות נויטרופילים באתר הפגיעה 2,3. מגוון רחב של in vivo ו בשיטות חוץ גופית התפתח כדי לאפשר את לימוד התהליכים האלה 4. שיטה זו מתמקדת גלגול נויטרופילים פני לתאי אנדותל אנושיים.

שיטה פופולארית לבחינת התהליכים המולקולריים המעורבים גלגול נויטרופילים מנצל n אדםeutrophils אינטראקציה עם תאים ראשוניים אדם וריד הטבור אנדותל (HUVEC) 5. בידוד נויטרופילים תוארה חזותית במקום אחר 6, ולכן מאמר זה יציג את שיטת הבידוד של HUVEC. מבודדים אחת גדלה המפגש, בתאי האנדותל מופעלים וכתוצאה מכך הגברת הביטוי של מולקולות הדבקה והפעלה. כך, למשל, הפעלה של תאים אנדותל עם ציטוקינים כגון TNF-אלפא גורם selectin-E מוגברת IL-8 הביטוי 7. E-selectin מתווכת ללכוד וגלגול של נויטרופילים ו IL-8 מתווכת הפעלה הידבקות חברה של נויטרופילים. לאחר הידבקות הנויטרופילים מתגלגלות. גלגול יכול להתרחש paracellularly (דרך צמתים תא האנדותל) או transcellularly (דרך תא האנדותל את עצמו). ברוב המקרים, אינטראקציות אלה מתרחשות בתנאים תזרים שנמצאו 7,8 בכלי הדם.

החדר במקביל זרימת צלחת היא מערכת בשימוש נרחב כי mimics גזירה הידרודינמית מדגיש למצוא vivo ומאפשרת לימוד גיוס נויטרופילים בתנאי זרימת במבחנה 9,10. מספר חברות לייצר במקביל הזרימה לתאי צלחת וכל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות. אם ניאון הדמיה יש צורך, זכוכית או פולימר דומה אופטית צריך לשמש. בתאי האנדותל אינם גדלים היטב על זכוכית.

כאן אנו מציגים שיטה קלה ומהירה הדמיה שלב לעומת זאת, DIC ו הניאון של גלגול נויטרופילים באמצעות בנפח נמוך ibidi ערוץ שקופיות עשוי פולימר, אשר תומך הידבקות מהירה וצמיחה של תאים אנדותל אנושיים ויש לו תכונות אופטיות, כי הם דומים זכוכית. בשיטה זו, בתאי האנדותל גדלו ועורר ב μslide ibidi. נויטרופילים הוכנסו בתנאים הזרימה ואת גלגול הוערך. הדמיה הניאון של צמתים לאפשר בזמן אמת קביעת היקף paracellular לעומתtranscellular גלגול.

Protocol

1. בידוד ותחזוקה של אדם לתאי אנדותל כלי דם רמה 2 הליכים biosafety יש להשתמש בעת עבודה עם דם ברקמות האדם. מספריים חותכים את כבל מן השליה ולאחר מכן לבדוק מקרוב את חבל על קרישי דם ונזק נגרם על ידי לחיצה כבל במהלך הלידה. לגזור וזו?…

Discussion

החוקרים השתמשו באופן קבוע לתאי אנדותל של כלי הדם מיטות שונות ללמוד גיוס גלגול נויטרופילים ו. דוגמאות כוללות, אך לא רק, עורי לתאי אנדותל כלי הדם, 12 סינוסי הכבד ותאי אנדותל 13 ותאי האנדותל מווריד הטבור האדם 10. ביניהם HUVEC לפופולריות רחבה בגלל הקלות היח…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר פינה Colarusso לבין תא חי מתקן הדמיה על עזרתם עם הדמיה ניתוח התמונה: גב 'Lailey לקבלת סיוע טכני שלה, היחידה 51 בבית החולים שפלת בקלגרי, א.ב. למתן חבלי הטבור אדם. ד"ר KD פאטל היא מתפתחת אלברטה: המדען Health Solutions. עבודה זו נתמכה על ידי מענק ההפעלה של המכון הקנדי למחקר בריאות מענקי ציוד ותשתיות מן הקרן הקנדית חדשנות המדע אלברטה רשות המחקר.

Materials

Reagent and Equipment Company Catalogue number Comments
Collagenase Type 1 Worthington 4197  
Cord buffer     Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4
Endothelial Cell Media (ECM)     M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml
M199 GIBCO 31100-035  
Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) Invitrogen 10378-016  
Ibidi chambers Ibidi 80606  
TNF-α Prepro Tech 300-01A  
Human Albumin 20% solution Gemini Bioproducts 800120050  
HBSS without Ca2+ and Mg2+ Sigma H2487-10X  
HBSS with Ca2+ and Mg2+ Sigma H1387-10X  

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  2. Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
  3. Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  4. Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
  5. Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
  6. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  7. Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
  8. Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
  9. Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
  10. Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
  11. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  12. Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
  13. Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
  14. Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
  15. Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).

Play Video

Cite This Article
Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).

View Video