Summary

分离人脐静脉内皮细胞和水流条件下其使用中的中性粒细胞轮回研究

Published: August 08, 2012
doi:

Summary

本文首先介绍了人类脐静脉内皮细胞的分离的过程,然后演示如何使用这些细胞检查流量条件下的中性粒细胞轮回。通过使用低体积流量室从玻璃的光学特性的聚合物制成,活细胞荧光成像罕见的细胞群也是可能的。

Abstract

中性粒细胞白血细胞中最丰富的类型。它们形成了一个1的先天免疫系统的重要组成部分。在急性炎症,中性粒细胞的炎性细胞迁移到损伤部位。损伤部位的中性粒细胞的招聘是一个循序渐进的过程,包括第一,扩张血管,增加血流量;第二,微血管结构变化和血浆蛋白从血液中逸出;第三,滚动,粘附和对面的中性粒细胞的轮回内皮细胞;和第四积累的中性粒细胞在损伤2,3网站。宽阵列在体内体外方法已发展到使这些过程的研究,4。这种方法侧重于在人类内皮细胞中性粒细胞轮回。

检查中性粒细胞的轮回中所涉及的分子过程的一个流行的方法是利用人Neutrophils相互作用与原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)5。中性粒细胞分离已直观地描述在别处6,因此本文将显示HUVEC的隔离方法。一旦分离,成长为汇合,内皮细胞被激活,产生粘附和活化分子的上调。例如,激活内皮细胞与细胞因子如TNF-α的结果增加了E-选择素和IL-8表达7。 E-选择素介导中性粒细胞和IL-8介导的激活和坚定的中性粒细胞粘附的捕获和滚动。后粘附中性粒细胞的轮回。轮回可以paracellularly发生,通过内皮细胞路口或transcellularly通过内皮细胞本身。在大多数情况下,这些相互作用的发现在血管7,8流条件下发生的。

平行板流动腔是一种广泛使用的系统,MI液力剪切应力话筒,发现在体内体外 9,10水流条件下使中性粒细胞招聘研究。有几家公司生产平行平板流室和每个人都有优点和缺点。如果荧光成像是必要的,需要使用玻璃或光学类似的聚合物。内皮细胞不生长在玻璃上。

在这里,我们提出了一个简便,快速的中性粒细胞轮回相衬,DIC和荧光成像的方法,用低量ibidi通道幻灯片,支持快速的人血管内皮细胞的粘附和生长,并具有光学质量相媲美的聚合物制成的玻璃。在此方法中,内皮细胞生长和刺激在ibidiμslide。中性粒细胞被引入流量条件下,轮回进行了评估。路口旁程度与决心使实时荧光成像跨细胞轮回。

Protocol

1。人血管内皮细胞的分离和维护与人体血液和组织工作时,必须使用2级生物安全程序。用剪刀剪线从胎盘的血块和在分娩过程中夹紧电线造成的损害,然后仔细检查电线。切出并丢弃这些线部分。 准备在1毫克/毫升,50毫升温线缓冲管,含有50毫克胶原酶注入新鲜的胶原酶溶液。 变成无菌手套和消毒钝套管,电线钳,剪刀,三路停止旋塞,在层流罩纱布打开蒸压仪器托盘。 …

Discussion

研究人员经常使用不同血管床的血管内皮细胞研究中性粒细胞的招聘和轮回。例子包括,但不仅限于,真皮微血管内皮细胞,肝窦内皮细胞1310人脐静脉内皮细胞。其中,人脐静脉内皮细胞获得了广受欢迎,因为它们相对容易隔离和可用性。 HUVEC的是一个强大的体外模型系统,可以模仿许多发生在体内的内皮进程。这个模型系统已帮助识别粘附分子和趋化因子?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢的翩Colarusso博士和协助成像和图像分析活细胞成像设备;女士为她的技术援助Lailey和单位在提供人类脐带在卡尔加里,AB山麓医院5​​1。川崎病帕特尔博士是艾伯塔创新:健康解决方案的科学家。这项工作是从加拿大健康研究,并从加拿大创新和阿尔伯塔省科学和研究的权威机构的基础设备和基础设施补助机构的经营拨款支持。

Materials

Reagent and Equipment Company Catalogue number Comments
Collagenase Type 1 Worthington 4197  
Cord buffer     Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4
Endothelial Cell Media (ECM)     M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml
M199 GIBCO 31100-035  
Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) Invitrogen 10378-016  
Ibidi chambers Ibidi 80606  
TNF-α Prepro Tech 300-01A  
Human Albumin 20% solution Gemini Bioproducts 800120050  
HBSS without Ca2+ and Mg2+ Sigma H2487-10X  
HBSS with Ca2+ and Mg2+ Sigma H1387-10X  

References

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Cite This Article
Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).

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