Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate
Summary
I virus influenzali replicare il loro genoma RNA in associazione con la cellula ospite cromatina. Qui, vi presentiamo un metodo per purificare intatti complessi ribonucleoproteina virali dalla cromatina delle cellule infette. Purificato complessi virali possono essere analizzati mediante Western blot e sia di estensione del primer di proteine e RNA, rispettivamente.
Abstract
Come tutti filamento negativo-virus ad RNA, il genoma di virus influenzali viene confezionato in forma di complessi ribonucleoproteina virali (vRNP), in cui è incapsidati singolo filamento genoma della nucleoproteina (NP), e associate con il complesso polimerasi composto trimerico della PA, PB1, e PB2 subunità. Tuttavia, contrariamente alla maggior parte dei virus a RNA, virus dell'influenza eseguire sintesi di RNA virale nei nuclei delle cellule infette. È interessante notare, sintesi di mRNA virale utilizza cellulari pre-mRNA come primer, ed è stato proposto che questo processo ha luogo sulla cromatina 1. Le interazioni tra la polimerasi virale e l'host RNA polimerasi II, nonché tra NP e nucleosomi ospitanti sono stati caratterizzati 1,2.
Recentemente, la generazione di virus influenzali ricombinanti codificanti una One-Strep-Tag geneticamente fuso al C-terminale della subunità PB2 della polimerasi virale (rWSN-PB2-Strep 3) ha essereen descritto. Questi virus ricombinanti permettono la purificazione di PB2 contenenti complessi, compresi vRNPs, da cellule infette. Per ottenere purificato vRNPs, colture cellulari sono infetti, e vRNPs sono purificati per affinità da lisati derivati da queste cellule. Tuttavia, le procedure di lisi utilizzati fino ad oggi sono stati basati su una fase di lisi detersivo, che, nonostante la presenza di una nucleasi generale, spesso estrarre cromatina materiale legato solo inefficiente.
Il nostro lavoro preliminare suggerito che una grande porzione di vRNPs nucleari non sono stati estratti durante la lisi cellulare tradizionale, e quindi non poteva essere purificato per affinità. Per aumentare questa efficienza di estrazione, e per separare cromatina-legato da vRNPs nucleari non-cromatina-bound, abbiamo adattato una graduale protocollo subcellulare di estrazione influenza cellule infettate da virus. In breve, questa procedura prima separa i nuclei dalla cella e poi estratti solubili proteine nucleari (qui chiamato frazione "nucleoplasmic").Il rimanente materiale insolubile nucleare viene poi digerito con BenzonaseTM, un DNA aspecifica / RNA nucleasi, seguita da due passi sale di estrazione: prima utilizzando 150 mM NaCl (denominato "CH150"), allora 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1 ). Queste fasi di estrazione del sale sono stati scelti sulla base della nostra osservazione che 500 mM NaCl è stato sufficiente a solubilizzare oltre l'85% del vRNPs nucleari ma ancora consentire il legame degli vRNPs tag alla matrice di affinità.
Dopo frazionamento subcellulare di cellule infette, è possibile purificare affinità vRNPs PB2-etichetta da ogni frazione individuo e analizzare le proteine e loro componenti RNA utilizzando Western Blot e la estensione di primer, rispettivamente. Recentemente, abbiamo utilizzato questo metodo per scoprire che vRNP forma export complessi durante i punti in ritardo dopo l'infezione sulla frazione cromatina estratta con 500 mM NaCl (ch500) 3.
Protocol
Discussion
Mentre molti studi hanno recentemente identificato singole proteine o reti cellulari coinvolti nella infezione da virus dell'influenza 8, il significato funzionale della maggior parte di queste interazioni è ancora chiaro. Data la dipendenza assoluta di cromatina basati funzioni per la sintesi di RNA del virus influenzale e la natura complessa biofisica e biochimica del nucleo 9, nuove tecniche saranno necessari per chiarire tali funzioni. Il frazionamento subnucleare che presentiamo qui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Nada Naffakh e Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) per la rWSN-PB2-Strep virus.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
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