זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים
Summary
נגיפי שפעת לשכפל גנום הרנ"א שלהם בשיתוף עם הכרומטין מארח תאים. כאן, אנו מציגים שיטה לטיהור שלמים מתחמי ribonucleoprotein ויראלי של הכרומטין של תאים נגועים. מטוהרים מתחמי ויראלי יכול להיות מנותח על ידי כתם הן המערבי תחל הרחבה של חלבון ותוכן RNA, בהתאמה.
Abstract
כמו כל הווירוסים שלילי גדיל RNA, הגנום של נגיפי שפעת ארוז בצורה של מתחמי ribonucleoprotein נגיפיים (vRNP), שבו הגנום חד גדילי הוא encapsidated ידי nucleoprotein (NP), הקשורים עם מורכבות פולימראז trimeric המורכב של הרשות הפלסטינית, PB1 ו PB2 יחידות משנה. עם זאת, בניגוד לרוב וירוסים RNA, נגיפי שפעת לבצע סינתזה של רנ"א נגיפי בגרעין של תאים נגועים. מעניין לציין, סינתזה mRNA ויראלי עושה שימוש הסלולר מראש mRNAs כמו primers, והוא הוצע כי תהליך זה מתרחש על הכרומטין 1. יחסי הגומלין בין פולימראז ויראלי המארח RNA פולימראז II, כמו גם בין NP ו nucleosomes המארחות יש גם לאפיין 1,2.
לאחרונה, דור של נגיפי שפעת רקומביננטי קידוד אחד סטרפטוקוקוס-Tag התמזגו גנטית הסופית-C של למקטע PB2 של פולימראז ויראלי (rWSN-PB2-סטרפטוקוקוס 3) יש להיותen תיאר. אלה וירוסים רקומביננטי לאפשר טיהור PB2 המכילים קומפלקסים, כולל vRNPs, מן התאים הנגועים. כדי להשיג מטוהרים vRNPs, בתרביות תאים נגועים, ו vRNPs הם זיקה מטוהרים מן lysates שמקורם בתאים אלה. עם זאת, ההליכים תמוגה בשימוש עד כה התבססו על צעד אחד תמוגה חומרי ניקוי, אשר, למרות נוכחותם של nuclease כללי, פעמים רבות לחלץ הכרומטין החומר הנכנס רק לא יעיל.
עבודה ראשונית שלנו הראו כי חלק גדול vRNPs גרעיני לא הופקו במהלך תמוגה התא המסורתי, ולכן לא יכולה להיות זיקה מטוהרים. כדי להגביר את יעילות מיצוי, וכדי להפריד הכרומטין, חייב מן הלא הכרומטין הנכנס vRNPs גרעיני, התאמנו את פרוטוקול צעד חכם החילוץ subcellular שפעת הווירוסים נגוע תאים. בקצרה, הליך זה 1 מפריד הגרעינים מהתא ואז מוציא חלבונים גרעיניים מסיסים (שמכונה כאן חלק "nucleoplasmic").החומר הנותר גרעינית מסיס מתעכל אז עם Benzonase, נוקבים DNA / RNA nuclease, ואחריו שני צעדים תעשיית מלח: 1 משתמש 150 מ"מ NaCl (המכונה "ch150"), ואז NaCl 500 מ"מ ("ch500") (איור 1 ). מיצוי הפעולות הבאות מלח נבחרו בהתבסס על תצפיות שלנו 500 מ"מ NaCl היה מספיק כדי solubilize מעל 85% vRNPs גרעיני אך עדיין לאפשר המחייב של vRNPs מתוייגים למטריצה את הזיקה.
לאחר חלוקה subcellular של תאים נגועים, אפשר vRNPs זיקה לטהר PB2-מתוייגים של חלק בנפרד ולנתח את החלבון שלהם ואת מרכיבי רנ"א באמצעות כתם המערבי והרחבה פריימר, בהתאמה. לאחרונה, השתמשנו בשיטה זו כדי לגלות בצורה מתחמי vRNP הייצוא במהלך נקודות המאוחרות לאחר ההדבקה על חלק הכרומטין חילוץ עם 500 mM NaCl (ch500) 3.
Protocol
Discussion
בעוד שמחקרים רבים זיהו לאחרונה חלבונים בודדים או רשתות הסלולר המעורבים זיהום בנגיף שפעת 8, משמעות תפקודית של רוב האינטראקציות הללו עדיין לא ברור. לאור התלות המוחלטת של הכרומטין מבוססי פונקציות עבור סינתזה שפעת RNA וירוס הטבע biophysical ו ביוכימיים מורכבים של גרעין <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות נדא Naffakh ומארי אן Rameix-Welti (מכון פסטר) על וירוס rWSN-PB2-סטרפטוקוקוס.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA–proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
