Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen
Summary
Influenza virussen repliceren hun RNA genoom in samenwerking met gastheer-cel chromatine. Hier we een methode intact viraal ribonucleoproteïne complexen zuiveren van chromatine van geïnfecteerde cellen. Gezuiverd virale complexen kunnen worden geanalyseerd door zowel Western blot en primer extension eiwit en RNA inhoud respectievelijk.
Abstract
Zoals alle negatief-RNA virussen is het genoom van influenza virussen verpakt in de vorm van virale ribonucleoproteïne complexen (vRNP), waarbij de enkelstrengs genoom is ingekapseld door het nucleoproteïne (NP) en verbonden met de trimere polymerase complex bestaande van de PA, PB1, en PB2 subeenheden. In tegenstelling tot de meeste RNA virussen, influenzavirussen uitvoeren viraal RNA synthese in de kernen van geïnfecteerde cellen. Interessant virale mRNA synthese gebruikt cellulaire pre-mRNA als primers, en is voorgesteld dat dit proces plaatsvindt op chromatine 1. Interacties tussen de virale polymerase en de gastheer RNA polymerase II, alsmede tussen NP en gastheer nucleosomen ook gekenmerkt 1,2.
Onlangs de productie van recombinante influenzavirussen codeert voor een een-Strep-tag genetisch gefuseerd met de C-terminus van het PB2 subeenheid van het virale polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) zijnen beschreven. Deze recombinante virussen kunnen de zuivering van pB2-bevattende complexen, zoals vRNPs van geïnfecteerde cellen. Voor het verkrijgen gezuiverd vRNPs worden celculturen geïnfecteerd en vRNPs zijn affiniteit gezuiverd lysaten uit deze cellen. Echter, de lysis procedures voor date gebaseerd op een stap wasmiddel lysis, die ondanks de aanwezigheid van een algemeen nuclease, vaak extract chromatine gebonden materiaal alleen inefficiënt.
Ons voorbereidend werk gesuggereerd dat een groot deel van de nucleaire vRNPs niet werden gewonnen tijdens de traditionele cellysis, en daarom geen affiniteit gezuiverd. Om deze extractie-efficiëntie te verhogen en te scheiden chromatine-gebonden van niet-chromatine-gebonden nucleaire vRNPs, hebben we aangepast een stapsgewijze subcellulaire extractie protocol om influenza virus-geïnfecteerde cellen. Kortom, deze procedure scheidt eerste kernen van de cel en extraheert oplosbare nucleaire eiwitten (hier aangeduid als de "nucleoplasmatische" fractie).De resterende onoplosbare kernmateriaal wordt dan geknipt met Benzonase een aspecifieke DNA / RNA nuclease, gevolgd door twee zoutwinning stappen: eerst met 150 mM NaCl (zogenaamde "ch150"), dan 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1 ). Deze zoutwinning stappen werden gekozen op basis van onze waarneming dat 500 mM NaCl was voldoende voor het oplossen van meer dan 85% van de nucleaire vRNPs maar toch kan de binding van gelabeld vRNPs om de affiniteit matrix.
Na subcellulaire fractionering van geïnfecteerde cellen, is het mogelijk om affiniteit zuiveren PB2-gelabeld vRNPs van elke fractie en analyse van de eiwit-en RNA componenten met Western Blot en primer extension, respectievelijk. Onlangs hebben we gebruikt deze methode om dat vRNP export complexen vorm te ontdekken tijdens de late punten na de infectie op de chromatine-fractie geëxtraheerd met 500 mM NaCl (ch500) 3.
Protocol
Discussion
Terwijl veel studies hebben recent geïdentificeerde individuele eiwitten of cellulaire netwerken die betrokken zijn bij influenza virus infectie 8, de functionele betekenis van de meerderheid van deze interacties blijft onduidelijk. Gezien de absolute afhankelijkheid van chromatine-gebaseerde functies voor influenza virus RNA synthese en de complexe biochemische en biofysische aard van de kern 9, zullen nieuwe technieken nodig zijn om deze functies toe te lichten. De subnucleaire fractionering pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Nada Naffakh en Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) bedanken voor de rWSN-PB2-Strep virus.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA–proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
