جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة
Summary
توليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (اللجنة التوجيهية) تنتج خطوط خطوط مختلفة المحتملة التنموية حتى عندما تمر الاختبارات القياسية لتعدد القدرات. نحن هنا وصف بروتوكول لإنتاج الفئران المستمدة كليا من iPSCs، الذي يحدد الخطوط التوجيهية وتعدد القدرات الكاملة امتلاك<sup> 1</sup>.
Abstract
إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) من الخلايا الجسدية يوفر وسيلة لخلق أدوات قيمة للبحوث الأساسية ويمكن أن تنتج أيضا مصدرا للخلايا المريض لعلاجات التجدد المتطابقة. قد يتم إنشاء iPSCs باستخدام بروتوكولات متعددة ومستمدة من مصادر متعددة الخلايا. ولدت مرة واحدة، ويتم اختبار iPSCs باستخدام مجموعة متنوعة من المقايسات المناعية بما في ذلك لتعدد القدرات علامات، وتوليد طبقات الجرثومية الثلاث في الهيئات مضغي الشكل ومسخي المبيض، مقارنات بين التعبير الجيني مع الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) وإنتاج الفئران خيالية مع أو بدون مساهمة سلالة الجرثومية 2 . الأهم من ذلك، خطوط التوجيهية التي تمر هذه الاختبارات تختلف تزال في قدرتها على إنتاج مختلف أنواع الخلايا المتمايزة 2. وهذا جعل من الصعب تحديد البروتوكولات التي الاشتقاق اللجنة التوجيهية، ومصادر الخلية المانحة أو أساليب اختيار هي الأكثر فائدة لمختلف التطبيقات.
الاختبار الأكثر صرامةما إذا كان خط الخلايا الجذعية لديها امكانات تنموية كافية لتوليد كل الأنسجة اللازمة لبقاء الكائن الحي (تعدد القدرات الكاملة يسمى) هو رباعي الصيغة الصبغية تكامل الجنين (TEC) 3-5. من الناحية الفنية، TEC ينطوي الكهربائي اثنين من خلايا الأجنة لتوليد رباعي الصيغة الصبغية (4N) واحد خلايا الأجنة التي يمكن زرعها في المختبر لمرحلة الكيسة الأريمية 6. ثم يتم حقن مضاعفا الجذعية المحفزة (2N) الخلايا (مثل المجالس الاقتصادية والاجتماعية أو iPSCs) في تجويف blastocoel من الكيسة رباعي الصيغة الصبغية ونقل إلى الإناث المتلقية للحمل (انظر الشكل 1). المكون رباعي الصيغة الصبغية للجنين تستكمل يساهم بشكل حصري تقريبا إلى الأنسجة خارج الجنين (المشيمة، الكيس المحي)، في حين أن الخلايا مضاعفا تشكل الجنين السليم، مما أدى إلى الجنين مشتق تماما من خط الخلايا الجذعية حقن.
مؤخرا، أفاد نحن اشتقاق خطوط التوجيهية التي تولد بتكاثر الفئران البالغةعبر TEC 1. هذه الخطوط التوجيهية أن تؤدي إلى الجراء قابلة للحياة مع الكفاءات من 5-13٪، وهو مشابه لالمجالس الاقتصادية والاجتماعية و3،4،7 النسبة التي أبلغت عن معظم خطوط التوجيهية الأخرى 8-12. هذه التقارير تظهر أن إعادة برمجة المباشر يمكن أن تنتج iPSCs المحفزة التي تطابق تماما المجالس الاقتصادية والاجتماعية في إمكاناتها التنموية وكفاءة توليد الجراء في اختبارات TEC. في الوقت الحاضر، فإنه ليس من الواضح ما يميز بين iPSCs المحفزة بالكامل وخطوط أقل قوة 13-15. وليس من الواضح أي الطرق سوف تنتج إعادة برمجة هذه الخطوط وفقا لأعلى كفاءة. نحن هنا وصف أسلوب واحد التي تنتج iPSCs بالكامل والمحفزة "اللجنة التوجيهية للجميع" الفئران، والتي قد تكون مفيدة للمحققين الذين يرغبون في تعدد القدرات مقارنة خطوط التوجيهية أو إنشاء معادلة مختلفة أساليب إعادة برمجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفئران توليد خطوط التوجيهية من استخدام المقايسات TEC يوفر اختبار صارمة لتعدد القدرات الوظيفية وجود خط التوجيهية. وهذا قد يكون من المفيد اختبار لتقييم الكفاءة النسبية لمختلف أساليب إعادة برمجة أو لتحديد خطوط التوجيهية التي قد تكون مفيدة للغاية لتوليد بعض أنواع الخلايا في المختبر. ويمكن استخدام الفئران المولدة من iPSCs لاختبار صارم الاستقرار طويل الأجل وtumorigenicity من اللجنة التوجيهية المستمدة من الأنسجة. وسوف يكون من المفيد هذا البروتوكول للمحققين الراغبين في توليد خطوط التوجيهية المحفزة بشكل كامل أو الفئران أو اللجنة التوجيهية للمقارنة بين الفائدة النسبية لمختلف أساليب إعادة برمجة.
لا تزال غير مفهومة تماما الآليات التي تتحكم في توليد وتحديد iPSCs المحفزة بشكل كامل وأنه من الممكن أن بعض خطوط التوجيهية المنتجة باستخدام هذه الطريقة لن اجتياز اختبار TEC. هناك عوامل عديدة قد تختلف بين التجارب بما في ذلك الخلفيات الوراثية، عيار lentiviral، وأنماط أنا lentiviralnsertion، المعلمات دورة الخلية من السكان المانحة، الاختلافات بين المختبرات في مختلف خطوات الإجراء TEC والنزعات متغير من iPSCs إلى المرفأ الانحرافات الجينية أو جينية. لضمان نجاح أفضل، ونحن نحرص على إقامة مستويات مناسبة من التعبير الجيني في التجارب lentiviral الاشتقاق اللجنة التوجيهية عن طريق اختبار التخفيفات الفيروسية على MEFs الرقابة لضمان أن يتركز كل بما فيه الكفاية لإنتاج فيروس يمكن اكتشافها التعبير الجيني لا يقل عن 80٪ ومثالي 100٪ من MEFs. وهذا يسمح لنا لتحديد خطوط مع نسخ متعددة من lentiviruses مختلفة مع الحد سمية للMEFs المستعمرات وانتاج الآبار دون الاكتظاظ. تجدر الإشارة إلى أن ثبت متعددة البروتوكولات الأخرى لإنتاج iPSCs مع إمكانات النمو الكامل، وذلك باستخدام أساليب متعددة ومصادر الخلية المانحة تشير إلى أن مسارات متعددة لتعدد القدرات الكاملة قد تكون موجودة 1،8-13،15. في الوقت الحاضر، اللجنة التوجيهية ومع ذلك، لا نهائية العلامات البيولوجية المحفزة بالكاملتم التعرف وبالتالي فإن الفحص لا يزال اختبار TEC الذهب القياسية ما إذا كان خط التوجيهية يمكن أن تولد كل خلية في الأنساب كائن حي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعم لKKB، شريطة MJB، وJLH KLN من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي، وصناديق بيو الخيرية برنامج علماء الطب الحيوي والأسرة استير أوكيفي مؤسسة B. ومؤسسة أسرة شابيرو. KKB هو E. دونالد ودليا B. باكستر مؤسسة الباحث كلية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM (high glucose) | Invitrogen | 11965-092 | |
| ES cell qualified FBS | Invitrogen | 104392-024 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | Sigma M7522 | |
| 0.1% Gelatin | Millipore | ES006-B | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| Medium 199 | Invitrogen | 11150-059 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| ESGRO (murine LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| Valproic Acid | Sigma | P4543 | |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| PBS Ca2+/Mg2+ | Invitrogen | 14040-133 | |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Invitrogen | 14190-144 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin, for superovulation, freeze-dried, 2,000 IU | Harbor-UCLA Research Institute | n/a | |
| Chorionic gonadotropin, human | Sigma | C1063 | |
| FHM medium with Hyaluronidase | Millipore | MR-056-F | |
| KSOM-1/2 AA medium | Millipore | MR-106-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Water, for embryo transfer, embryo tested | Sigma | W1503 | |
| Mineral oil, embryo tested | Sigma | M5310 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Bovine serum albumin (BSA), embryo tested | Sigma | A3311 | |
| Mouse embryonic fibroblasts, non-irradiated | Millipore | PMEF-CFL | |
|
Media and buffers used in this protocol HEK293T growth medium. 90% DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Exclude penicillin and streptomycin from HEK media used on day of transfection. HEK medium can be stored at 4 °C for up to 1 month. 2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4·7H2O, 12 mM Dextrose. pH to 7.1 +/- 0.1. pH is critical! Sterile filter and store at 4 °C. Mouse embryonic fibroblast (MEF) growth medium (also for use with feeders). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Store at 4 °C for up to 1 month. ESC growth medium. 85% DMEM,15% ES cell qualified FBS, 1x Glutamax, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1,000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. ESC media can be stored at 4 °C for up to three weeks. Electrofusion medium. 0.3 M Mannitol, 0.1 mM MgSO4, 50 mM CaCl2, and 3% BSA in embryo tested water. Store at 4 °C for up to 3 months. |
References
- Boland, M. J., et al. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature. 461, 91-94 (2009).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).
- Eggan, K., Jaenisch, R. . Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation. , (2006).
- McLaughlin, K. J. Production of tetraploid embryos by electrofusion. Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).
- Humpherys, D., et al. Epigenetic instability in ES cells and cloned mice. Science. 293, 95-97 (2001).
- Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).
- Zhao, X. Y., et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature. 461, 86-90 (2009).
- Kang, L., et al. Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation. Cell Res. 21, 546-549 (2011).
- Zhao, X. -. Y., et al. Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).
- Han, J., et al. Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells. Nature. 463, 1096-1100 (2010).
- Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).
- Stadtfeld, M., et al. Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells. Nature. 465, 175-181 (2010).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
- Go, W. Y., Ho, S. N. Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems. The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).
- Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nature. 26, 795-797 (2008).
- Li, X. -. y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).
- George, S. H. L., et al. Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2003).
- Kirak, O., et al. Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT. J. Vis. Exp. (43), e2168 (2010).
