Procedimiento experimental: 1. Transfección con Amaxa ratón de células T nucleofector Kit Se describe aquí la transfección de un ingenuo o in vitro, las células T activadas primaria con plásmidos de expresión que codifican moléculas de señalización marcados por las buenas prácticas agrarias, utilizando el ratón de células T Amaxa nucleofector kit. In vitro la activación de células T utilizando péptido-cargados APC esplénicas se realiza como se ha descrito antes 7. Todas las células T se utilizan en nuestros estudios expresar el TCR y que reconoce MCC péptido (88-103) unido a la molécula MHC es decir, K. La transfección se lleva a cabo esencialmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, sin embargo, se presentan algunos consejos que promueven la viabilidad de las células T después de la transfección. Tanto la viabilidad y la eficacia de transfección es mucho mayor en in vitro las células T activadas que en las células no tratados previamente. Antes de comenzar, preparar 2 ml de medio suplementado células T mediante la adición de 20 l deambos componentes del medio A y B y 100 ul de suero fetal bovino (5%) para cada transfección a realizar. Equilibrar el medio en una placa de 12 pocillos en una humidificado 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante al menos una hora. Alternativamente, alícuotas de medio suplementado con 5% de suero y el componente A puede prepararse y almacenarse congelado. Si este es el caso, descongelar el número requerido de alícuotas, añadir el componente B, y realizar la equilibración. – Pre-equilibrado del medio es muy importante, ya que la muerte celular será el resultado de la re-suspensión de células después de la transfección en medio que es frío o tiene un pH que no sea 7,2. A continuación, preparar la mezcla de transfección. Combinar 82 l de solución de ratón nucleofector de células T con 18 l de suplemento 2 y 5μg de ADN plásmido (concentración no inferior a 0,5 g / l). Mezclar bien tocando el tubo o con el uso de micro pipeta. -Es importante realizar una titulación de dosis plásmido para un número fijo de células para cada construcción que se utilizará para la transfección. Para algunas construcciones más grandes, más ADN puede ser requerido. ADN debe estar libre de endotoxinas. Transferencia de 5 a 10 millones de células a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 600 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Eliminar la mayor cantidad de sobrenadante como sea posible con un aspirador de vacío. – Los fabricantes recomiendan hacer girar las células en menos de 90x g, en nuestro caso, esta velocidad corresponde a 75x g. El elegido fuerza centrífuga relativa (FCR) para obtener un sedimento celular es quizás la variable más crucial, ya que la centrifugación a baja RCF se opone a los daños a la membrana celular. Vuelva a suspender el sedimento celular en la mezcla de transfección con suavidad y lentamente pipetear el sedimento celular hasta que no hay grandes grumos de células restantes. Normalmente, esto puede lograrse completamente aspirando las células Tediante la punta de la pipeta no más de 3-4 veces. Con una pipeta, transferir cuidadosamente la suspensión en una cubeta Amaxa certificada, asegurando que no hay burbujas presentes. Tapar la cubeta. Seleccione el programa nucleofector X-001 en el dispositivo nucleofector. Inserte la cubeta en el soporte de la cubeta nucleofector y aplicar el programa seleccionado. – Después de electroporación de las células, lo mejor es inmediatamente la transferencia al medio de cultivo pre-equilibrio. Los fabricantes recomiendan que las células se mantienen en el medio nucleofector por no más de 15 minutos. Lleve la cubeta y la pre-equilibrio, medio totalmente completada la cultura a la campana. Utilizando la pipeta de plástico, y agregue aproximadamente 500 l del medio a la cubeta y transferir la suspensión de células al medio en la caída de la placa a gota. Se incuban las células a 37 ° C durante 4 horas antes de imágenes. Células de los animales son incubadased a 30 ° C en lugar de 37 ° C. Esto ayuda a mantener su reactividad frente a antígeno. – De tres a cuatro horas de incubación es generalmente suficiente para las células T para expresar las proteínas de la GFP detectable etiquetados. Elegimos a las células de imagen en este momento el tiempo debido a que el nivel de expresión es baja y los artefactos de la sobre-expresión debe reducirse al mínimo. Si la sobre-expresión de una proteína particular, se desea, sin embargo, las células T debe ser retirado del medio Amaxa después de 4 horas. Esto se logra de nuevo nodulizando las células a RCF baja y resuspender en preequilibrada medio de cultivo de células T suplementado con 50 U / ml de interleucina 2 (IL-2) a una densidad de 2 millones de células / ml. 2. TIRF de Microscopía Descripción del microscopio TIRF: Generales de configuración: componentes ópticos fueron construidos alrededor de un microscopio de fluorescencia Olympus IX71 que originalmente estaba equipado con un módulo de Olympus TIRF. Pronto discovered efectos cromáticos en este módulo cuando un estado de alineación única no logró la colimación coincidentes para las líneas de láser de diferentes longitudes de onda. Este módulo, por lo tanto, no permitiría simultánea de imágenes TIRF con diferentes longitudes de onda de excitación, y nos dispusimos a construir un aparato de medida TIRF que minimice los efectos cromáticos en el sistema, como veremos en detalle en las secciones siguientes. El método aquí descrito fue desarrollado para la ampliación de 150 X, 1,45 apertura numérica (NA) TIRFM objetivo (Olimpo), pero funciona igual de bien para la ampliación de 60 X, versiones 1.45 NA. Para la iluminación de campo amplio, el microscopio está conectado a una fuente de luz de halogenuro metálico Lambda-XL y una rueda de filtros de excitación (Instrumentos Sutter) equipado con filtros de excitación. Para el posicionamiento automático de la etapa de la muestra con respecto al objetivo, el microscopio está equipado con una traducción motorizado XY, piezo-controlada Z etapa (ASI). Las imágenes se capturaron con dos idénticos QuAntem de electrones multiplicando (EM) cámaras CCD (Fotometría). El tamaño de píxel de las cámaras coincide muy bien con el aumento ofrecido por el objetivo de 150 X TIRF, dando una resolución final de 0,1 m por píxel. Las cámaras también ofrecen EMCCD la sensibilidad para visualizar las buenas prácticas agrarias transfectantes con bajo nivel de expresión. Láser: Para TIRF iluminación, un sistema de láser de 5 la entrega de un total de 6 líneas de láser (405 nm, 440, 488, 514, 561 y 640) se acopla a una fibra monomodo (Tecnologías de la Solamere). El láser de argón y 561 nm diodo bombeado de estado sólido (DPSS) láser (líneas 488, 514 y 561) se encaminan a través de una fibra sintonizable óptico-acústico (AOTF) para el control de intensidad, mientras que la intensidad de los láseres de diodo (405, 440 y 640 nm) es controlada por la modulación de la tensión de sus fuentes de alimentación. La tensión en la AOTF y las fuentes de alimentación de los láseres de diodo es controlado a través de una tarjeta de adquisición de datos (CAD) junta (Medición Computación) utilizando el software MetaMorph (molelar dispositivos). La eficiencia de acoplamiento para los láseres de diodo es de 30%, mientras que las de los láseres de argón y DPSS son aproximadamente 60% debido a sus diámetros de haz más pequeñas. TIRF módulo: Con el fin de al mismo tiempo la imagen de la TCR y sus moléculas de señalización, según lo descrito anteriormente, era indispensable contar con la iluminación TIRF que fue corregido cromáticamente y que no requieren realineación o reenfoque en la adquisición de las emisiones de fluorescencia de diferentes longitudes de onda. TIRFM se logró utilizando través de-la-objetivo iluminación, como se ha descrito antes 17. El cable de fibra óptica que ofrece la luz del láser del microscopio fue asegurado en una lancha de fibra equipada con un soporte de fibra de XY montado sobre un riel óptico micrométrico impulsada por la Z de ajuste (Thorlabs). Para lograr TIRF iluminación, el rayo láser está enfocado en el plano focal posterior del objetivo utilizando un sistema de dos lentes (L1 (colimación lente) y L2 (lente de enfoque) en la Figura 1), de modo que el bEAM emerge colimado del objetivo. Esto asegura que todos los rayos de luz que sale del objetivo tendrá el mismo ángulo con respecto al plano de la muestra. La punta de la fibra óptica se coloca en el foco de la lente colimadora. Al mover el micrómetro a lo largo del carril óptico con respecto a la lente de colimación (dirección Z) es posible ajustar el enfoque del haz y mover la viga en posición X e Y utilizando los botones de ajuste XY. Debido a la abertura posterior muy pequeña del objetivo 150 X, hemos encontrado que para lograr TIRF, el tamaño del punto láser en el plano focal posterior necesaria para ser pequeña. Para lograr el enfoque necesario para producir el pequeño punto, las lentes de distancia focal corta eran necesarias (Keir Neumann, comunicación personal), de ahí, se utilizó una lente de enfoque con una longitud focal de aproximadamente 108 mm que se colocó en el cubo dicroico inmediatamente anterior el objetivo. La lente de colimación se colocó más cerca del divisor de haz que trajo a la TIRF iluminación. Para minimizar los efectos cromáticos deseados, hemos utilizado dobletes acromáticos (lente cromáticamente corregida hecha por fusionando elementos de lentes de dos hechos de materiales de diferentes índices de refracción) con recubrimientos antirreflectantes tanto para la colimación y lentes de enfoque (JML óptica). El enfoque puede ser verificada mediante la comprobación de que el haz colimado emerge fuera del objetivo cuando se encuentra en el centro de la abertura hacia atrás y deben formar un aprieto en el techo de la sala. La posición del punto enfocado se mueve entonces hacia el borde de la abertura (en la dirección Y), que hace que el haz para converger en el plano de imagen en ángulos grandes, y, finalmente, el ángulo crítico de reflexión total interna se logra. El uso de estos componentes ópticos, se logró la colimación simultánea para todas las longitudes de onda de 442 a 640 nm en la misma alineación. Una alineación óptica única, por lo tanto, nos ha permitido llevar a cabo TIRFM simultáneamente a través de múltiples longitudes de onda. Aparente de doble cámaraATUS: adquisición simultánea de la emisión de fluorescencia distinta derivada de dos fluoróforos diferentes se logró mediante la construcción de un sistema de doble cámara que se divide la emisión en dos rangos de longitudes de onda mediante el uso de espejos dicroicos (Figura 2). La luz emitida es reflejada desde el objetivo del puerto lado derecho del microscopio. Como la mayoría de los objetivos son corregidos al infinito (con imágenes formadas en el infinito), una lente de tubo se requiere para enfocar la imagen. Para manipular dos longitudes de onda de emisión de forma simultánea, la lente del tubo en el orificio lateral derecho se eliminó. Un adaptador personalizado que contiene c-mount temas (Sutter Instruments) fue unido y vinculado a un soporte de espejo dicroico (Edmund Optics). Espejos dicroicos que separan la emisión GFP de la de tintes orgánicos utilizados para etiquetar el TCR (Alexa546, Alexa647, etc) se instalaron en este soporte. Este módulo fue seguido en ambas trayectorias de luz por un tubo de soporte de la lente, un soporte de filtro de emisión y los tubos de extensión. LaLas lentes de tubo (TL1 y TL2 (Figura 2)) tiene una longitud focal de 180 mm. Las brechas en los tubos de extensión que conducen a las cámaras CCD EM fueron cubiertos con papel negro para proteger a las cámaras de la luz parásita. Para permitir la alineación de los dos canales, las cámaras fueron montadas en dos stands personalizados de traducción XYZ (Productos Holmarc). A continuación se describe la forma de alinear el microscopio para obtener imágenes de dos canales simultáneos. Los pasos a seguir son la alineación de la iluminación TIRF, ajustando la potencia del láser, y la alineación de las dos imágenes de salida, utilizando sub-resolución de microesferas. Antes de comenzar, todos los componentes del microscopio están encendidos. El ordenador y el software se inició entonces y se garantiza que todos los componentes de hardware son reconocidos por el software. Para su uso como una norma co-localización, diluir 1 l de sub-resolución (0,2 micras) Fluoresbrite multi-microesferas fluorescentes en 2 ml de PBS y añadir 0,25 ml de la microesferasuspensión a cada pocillo de una II de Lab-Tek 8-bien cámaras sistema cubreobjetos (Nunc). Coloque el sistema de deslizamiento de cámara en la plataforma por encima del objetivo. Perlas que se adsorben a la copa se pone entonces en el foco. Uso de la alineación Y del lanzamiento fibra XYZ, la posición del haz de láser se mueve hacia el centro de la abertura posterior del objetivo. Es importante hacer esto cuando el objetivo está en la posición donde el plano de vidrio está en el foco. Si el haz no está colimado, el micrómetro Z se ajusta para lograr colimación completo. Colimación se prueba individualmente para todas las líneas de láser para ser utilizados en el experimento. En esta etapa, la potencia del láser para cada línea se mide utilizando un medidor de potencia del láser y se ajustó a 20-30 mW en cada canal. -Las células T son extremadamente sensibles a la radiación láser, y la iluminación se limita a un total de 50 mW. Imágenes de las perlas se adquieren utilizando TIRF Illuminationes en el modo directo. Girar el micrómetro Y-alineación en el lanzamiento de fibra de modo que el haz comienza a moverse lejos del techo hasta su ángulo con respecto a los enfoques el objetivo de ejes ópticos 90 grados. Finalmente, cuando el ángulo crítico para la TIR se alcanza, la luz láser ya no salir del objetivo. Alineación TIRF se juzga centrándose arriba y hacia abajo a través del plano del cubreobjetos. Si perlas que están flotando en solución puede ser visualizado, entonces el ángulo del haz con respecto a las necesidades normales de objetivos que se aumentó aún más. En la correcta alineación TIRF, sólo un plano óptico estará en el foco (es decir, sólo las perlas que se adsorben a la cubreobjetos). Una prueba más fino de la alineación TIRF puede ser implementado cuando las imágenes de las células T teñidas con un colorante de superficie que se han extendido sobre una superficie. (Véase el punto 3.4). Después de iluminación TIRF se ha logrado, los dos canales pueden estar alineadas con respecto a la otra. Centrarse en las cuentas y compare la posición de icaracterísticas dentifiable en las imágenes producidas en ambos canales. Uso de la X y tornillos micrométricos Y en un soporte de la cámara, llevar la posición relativa de las perlas en la proximidad cercana posible. Guarde las imágenes de ambos canales. Estas imágenes se utiliza como un estándar co-localización para alinear los dos canales. Las cámaras también tienen que estar alineadas de modo que sean parafocal con respecto a otra. Esto se logra mediante la adquisición de un conjunto de imágenes de las perlas de sub-resolución que están separados unos de otros en la dirección Z por 100 nm. Si el píxel intensidad máxima para las perlas se encuentra en el mismo plano, tanto para las cámaras, entonces son parafocal. 3. Imágenes Una vez que el microscopio está configurado, la siguiente tarea es preparar a los cámaras de flujo de vidrio que contienen el apoyo bicapas lipídicas que presentan las moléculas de antígeno y la adhesión a lo descrito previamente 6 y luego realizar TIRFM de las células T transfectadas que interactúan con elsustrato. La bicapa publicado protocolo 5-6 Se siguió publicado excepto que los liposomas no se incubaron durante 20 minutos sobre el cubreobjetos después de la cámara de flujo fue montado. En su lugar, HBS-BSA tampón se corría en la celda de flujo inmediatamente después del montaje. Montar una cámara de flujo con bicapas lipídicas planas formadas sobre el cubreobjetos de vidrio que contienen Ni-NTA lípidos. Las moléculas de adhesión, la ICAM-1 (100 moléculas / micras 2), y complejos de péptido-MHC, la MCC cargado es decir, K (moléculas 5-10 micras o 2), se incorporan en la bicapa mediante sus etiquetas de histidina. La molécula CD80 estimuladoras se agrega mediante un ancla de GPI (100 micras moléculas / 2). Colocar la celda de flujo en la platina del microscopio y estabilizarlo. Una el fabricante suministra el elemento de calentamiento en la celda de flujo para controlar su temperatura. Coloque el objetivo en una bicapa y traer el avión de dos capas para enfocar. Habilitar calentamiento del objetivo y el flujocelular para estabilizar la temperatura de la cámara a 37 ° C. Transfectadas Las células T son sedimentó después de 4 horas de incubación a una velocidad de 80x g, y de re-suspendido en HBS-BSA tampón y suplementado con 10 mg / ml de H57 Fab o 20 mg / ml de H57 solo fragmento variable de la cadena (scFv) a etiquetar el TCR. Las células se inyecta entonces en las células de flujo. Imagen se realiza en la presencia continua de los Fab o scFv debido a su alta constante de disociación. Su presencia en el medio no aumenta significativamente el fondo como el campo TIRF es muy delgada. Condiciones de imagen están configurados de modo que la adquisición de doble canal en vivo muestra una vista previa en vivo de los canales de TCR y de las buenas prácticas agrarias que ayuda en la búsqueda de las células transfectadas. TIRF de iluminación se confirma, centrándose el plano de vidrio para detectar cualquier tinción de la membrana lateral. Si las membranas laterales no vienen a continuación, en el enfoque de la alineación TIRF es bueno. Las células transfectadas son luego fotografiada una vez o en una secuencia de imágenes para producir videos. 4. Procesamiento de imágenes y análisis de datos El software genera imágenes de las dos cámaras en un solo marco. La salida de cada cámara es de 512 x 512 píxeles, por lo que la imagen de salida es de 1024 x 512 píxeles de tamaño. Las primeras imágenes que se divide en cuadros individuales correspondientes a las dos cámaras. Las imágenes de resolución sub-cuentas de los dos canales se superponen y los parámetros de alineación se determinan. Una característica específica a nuestro sistema es una rotación grado 1 de un canal con respecto a la otra (ver Figura 3). La fuente más probable de esta rotación es la tribuna de la cámara. Después de esta rotación transformaciones lineales más relativos en X e Y deben ser realizados para alinear perfectamente las perlas con respecto a la otra. Las imágenes de perlas se obtienen en cada experimento para determinar los parámetros precisos para alinear los dos canales. Estas transformaciones lineales y de rotación se aplica luego a todo elimágenes y, a continuación están sujetos a los algoritmos de segmentación y análisis de co-localización. 5. Los resultados representativos El sistema aquí descrito se puede adaptar para estudiar aguas abajo de señalización de cualquier receptor en la membrana plasmática. Es particularmente informativa en el estudio de la señalización del TCR, porque la señalización se produce en grupos ópticamente resueltos llamados TCR microclusters o en endosomas como se describió recientemente 18. Si la señalización se produjeron en los grupos sub-resolución de los receptores o en un-agrupados receptores experimentos adicionales tendría que hacer para interpretar los datos. Como se mencionó antes, las cadenas CD3 del complejo TCR someterse a la fosforilación por la quinasa familia Src Lck sobre el compromiso del TCR por péptido-MHC complejos. La cadena CD3 fosforilada, se movilizan de la quinasa de la familia Syk Zap70. Visualización de la contratación de Zap70 por lo tanto se informa sobre el estado de fosforilación de la cadena CD3. La fuerza de la estimulación de TCR puede alterarse mediante el uso de péptidos mutados en los residuos de contacto TCR. Estos péptidos son llamados ligandos peptídicos alterados (MTA). Un experimento representativo se muestra en la Figura 4, donde los péptidos agonistas robustamente recluta Zap70 a microclusters TCR mientras que la menor potencia péptido T102L falla para reclutar Zap70 a TCR microclusters, demostrando que la cadena CD3 no se fosforila en este caso. Podríamos llegar a esta conclusión porque teníamos que observar sólo la contratación de Zap70 a las agrupaciones de TCR que fueron detectados fácilmente por TIRFM. Un algoritmo de segmentación automática se utiliza para contar el número de ZAP70 microclusters por celda. También se muestra en la película es complementaria de la imagen simultánea de TCR y Zap70 asociado fluorescencia. Tenga en cuenta la naturaleza dinámica de lamelipodium. <br /> Figura 1. Imagen y esquemática de la costumbre lanzamiento TIRF. El panel A muestra la fotografía del lanzamiento TIRF como instalado en el microscopio, y el panel B es un esquema de la puesta en marcha TIRF demostrando la trayectoria de la luz. El esquema y la imagen que muestra la posición de la lente colector, el divisor de haz, el lanzamiento de fibra con X, Y y Z ajustes, la L1 lente de colimación, y la lente de enfoque L2 instalado en el cubo dicroico y el objetivo TIRF. El recuadro muestra la lente de enfoque instalado en el cubo dicroico. Figura 2. Imagen, y esquemática del sistema de cámara dos. El panel A muestra la fotografía del sistema de cámara dos como adjunta al microscopio, y el Panel B es una representación esquemática de la misma. El esquema y la imagen muestra la posición del objetivo, espejo, dicroicos, lentes de tubo TL1 y TL2, las emisiones de los filtros F1 y F2, las dos cámaras C1 y C2 en las camisetasheredero se encuentra con su respectiva X, Y y Z ajustes. Figura 3. El uso de sub-resolución perlas para alinear los dos canales. Los paneles A y B muestran superposiciones de cuentas sub-resolución antes (A) y después (Grupo B) de alineación. El panel A muestra que uno de los canales se hace girar con respecto al otro. Los paneles C y D son una subsección de las imágenes en A y B. Grupo E muestra una imagen del canal de superposición de dos células sin tratamiento. Parámetros de alineación utilizados en el panel D se aplica a la imagen se muestra en el panel de aviso F. cómo el lamelipodium de los dos canales está perfectamente alineado en el panel F y no en el panel de E. barra Escala 4 micras para todos los paneles. Figura 4. Zap70 contratación de TCR microclusters en respuesta a las minas terrestres antipersonal diferentes. In vitro activado y T Las células fueron transfectadas con un plásmido que codifica Zap70 fusionado a GFP y se incubaron en vidrio soportada de Ni-NTA bicapas que contienen 6 moléculas / 2 micras de péptido cargado Su-etiquetados-es decir, K, 100 moléculas / 2 micras de Alexa647 conjugado Su-etiquetados ICAM- 1 y 100 micras moléculas / 2 de GPI-ancladas CD80. Los péptidos cargados se indican en el recuadro. ICAM-1 se refiere a las celdas de bicapas que contienen moléculas / 100 micras 2 de Alexa-647 conjugado Su-etiquetados de ICAM-1. De dos canales de adquisición simultánea microscopía TIRF se realizó en la presencia continua de Alexa546 conjugado H57 fragmento Fab (sin bloqueo) para teñir el TCR. Las celdas eran imágenes hasta una hora después del contacto inicial con la bicapa. El número de racimos por ZAP70 células se analizaron mediante un software de clúster conteo automatizado. Al menos 40 células se analizaron en cada caso. Barra de nivel 2 micras para todas las imágenes. 92/3892fig5.jpg "/> Figura 5. Alineación del sistema de cámara utilizando dos tipos diferentes de dos cámaras. Este panel muestra la superposición alineada de cuentas sub-resolución de imágenes utilizando el sistema de dos cámaras en las dos cámaras tienen diferentes tamaños de pixel (verde: 6,45 m de tamaño de píxel fotografiada a hurgar en la basura 2×2 y rojo: talla 16 m pixel fotografiada sin binning). El recuadro muestra la vista ampliada de la caja cuadrada en el centro del campo. Barra de escala 5 micras. Película Complementario. Zap70 contratación de microclusters TCR en respuesta al péptido agonista. In vitro activado y las células T fueron transfectadas con un plásmido que codifica Zap70 fusionado a GFP y se incubaron en vidrio soportada de Ni-NTA bicapas que contienen 6 moléculas / 2 micras de péptido cargado Su-etiquetados-es decir, K, 100 moléculas / 2 micras de Alexa647 conjugado Su-etiquetados moléculas ICAM-1 y 100/2 micras de GPI-ancladas CD80. De doble canal simultáneo de uncquisition microscopía TIRF se realizó en la presencia continua de Alexa546 conjugado H57 fragmento Fab (sin bloqueo) para teñir el TCR. Un campo de las células transfectadas fue fotografiada repetidamente 40 veces con una resolución de tiempo de 10 segundos por fotograma. Barra de nivel 2 micras. Haga clic aquí para ver la película complementaria .
