والتقسيم من البروتينات، سواء داخل غشاء البلازما أو في مواقع داخل الخلايا هي واحدة الآلية التنظيمية التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير نتائج إشارة، وبالتالي فهم إشارات من المهم دراسة السلوك المكاني والزماني للبروتينات المعنية. نحن هنا وصف نظام الفحص المجهري TIRF يستند إلى دراسة نقل الإشارات في الخلايا التائية، ولكن قابلة للتطبيق على نطاق واسع.
وبدأت إشارات من خلال مستقبلات الخلايا التائية (TCR) عندما تشارك بها شظايا الببتيد مستضدي ملزمة بمركب التوافق النسجي الأكبر (الشركة الفلسطينية للرهن) البروتينات وأعرب على سطح الخلايا مستضد تقديم (ناقلات الجنود المدرعة). ويتألف المجمع من TCR TCRαβ مثنوي مغاير يجند ملزم أن الزميلة غير تساهمي مع CD3 dimers (وεδ وεγ heterodimers وhomodimer ζζ) 1. على إشراك مستقبلات، وفسفرته سلاسل ζ CD3 من قبل عائلة كيناز SRC، LCK. هذا يؤدي إلى تجنيد من عائلة كيناز SYK، Zap70 الذي فسفرته ثم وتفعيلها من خلال LCK. بعد ذلك، Zap70 phosphorylates محول البروتينات اللات وSLP76، والشروع في تشكيل مجمع الإشارات القريبة التي تحتوي على عدد كبير من مختلف الجزيئات يشير الى 2.
تشكيل هذه النتائج في نهاية المطاف في مجمع الكالسيوم وهيئة تنظيم الاتصالات التي تعتمد على رأسnscription تفعيل عامل والشروع يترتب على ذلك من سلسلة معقدة من البرامج التعبير الجيني التي تؤدي إلى تمايز الخلايا T 2. إشارات TCR (والدولة الناتجة من تمايز) هي عن طريق التضمين العديد من العوامل الأخرى، بما في ذلك قوة مستضد والحديث المتبادل مع co-stimulatory/co-inhibitory، chemokine، ومستقبلات خلوى 3-4. دراسة التنظيم المكاني والزماني للمجمع إشارات الداني في ظل ظروف تنشيط مختلف ولذلك فإن المفتاح لفهم المسار إشارات TCR، فضلا عن تنظيمها من قبل مما يشير الى مسارات أخرى.
نظام واحد نموذجا مفيدا جدا لدراسة الإشارات التي بدأها TCR في غشاء البلازما في الخلايا التائية هي طبقات ثنائية الزجاج المدعومة من الدهون، كما هو موضح سابقا 5-6. ويمكن استخدام ما لتقديم مجمعات الشركة الفلسطينية للرهن المستضدية، التصاق، والجزيئات شارك في تنشيطية لخلايا T-بمثابة ناقلات الجنود المدرعة الاصطناعي. بواسطة التصوير خلايا تي التفاعل معطبقة ثنائية الدهن باستخدام مجموع مضان انعكاس داخلي المجهري (TIRFM)، يمكننا الحد من الإثارة على بعد 100 نيوتن متر من المسافة بين الزجاج وسطح الخلية 7-8. هذا يسمح لنا صورة الأحداث التي وقعت في المقام الأول يشير تحدث في غشاء البلازما. كما نحن مهتمون في مجال التصوير تجنيد البروتينات مما يشير إلى مجمع TCR، ونحن تصف اثنين من الكاميرا نظام التصوير TIRF فيه على TCR، وصفت مع فاب فلوري (مستضد جزء ملزم) أجزاء من الجسم المضاد H57 (تنقيته من ورم هجين H57-597 ، آي تي سي سي، عدد ATCC: لا يجوز تصوير HB-218) التي هي محددة لTCRβ، والبروتينات مما يشير، الموسومة ب GFP، في وقت واحد في الوقت الحقيقي. هذه الاستراتيجية هو ضروري نظرا لطبيعة ديناميكية للغاية من خلايا تي وكلا من الأحداث يشير إلى أن تحدث في TCR. وقد سمحت هذه طريقة من طرق التصوير الباحثين ليغاندس صورة واحدة 9-11، فضلا عن تجنيد من الجزيئات مما يشير إلى تنشيط مستقبلات وهو نظام ممتاز لدراسة الكيمياء الحيوية في الموقع 12-16.
نحن هنا وصف نظام لدراسة الإشارات في مستضد محدد أساسي خلايا تي فأر باستخدام TIRFM وطبقات ثنائية زجاج الدهون كما دعمت ناقلات الجنود المدرعة الاصطناعي. هذا الاسلوب يعتمد على التعبير عن البروتينات بنجاح GFP المفتاحية في هذه الخلايا. Transfecting الخلايا التائية هي دائما مهمة صعبة. عادة، يتم استخدام electroporation أو الجينات تسليم باستخدام الفيروسات أو lentiviruses. أسلوب واحد ليست متفوقة على الآخر، وكلاهما يكون لها حدود ومزاياها. نجد أن electroporation والمزايا التالية: 1) لا يشترط أن يتم تقسيم خلايا نشطة كما هو مطلوب من أجل الفيروسات ولكن ليس lentiviruses، و 2) يمكن التحكم في مستوى التعبير من خلال تغيير وقت يتم تحضين الخلايا قبل التصوير. والعائق الاكبر هو أننا نجد صعوبة بالغة في التعبير عن البروتينات التي تكون كبيرة في الحجم في خلايا أولية. لقد قدمنا الأسلوب الذي يعطينا جيد جدا بقاء الخلية بعد electroporation. ونتيجة لذلك فمن applicabجنيه إلى استخدامه لتحقيق إسكات الجينات بوساطة سيرنا.
وصفنا أيضا هنا مخصصة 2 قناة TIRF اكتساب المجهر في وقت واحد الذي تم تصحيحه لونيا ولا يتطلب المواءمة منفصلة لأطوال موجية مختلفة. هذه القدرات، ومع ذلك، متوفرة تجاريا. ويستند نظامنا على مبادئ الفحص المجهري TIRF نشرت من قبل خبراء في الميدان، وأرخص من البدائل التجارية. واحد من انتقاد ممكن تصميم لدينا هو اننا نستخدم نفس الزاوية من حدوث موجات لإثارة مختلف. هذا من شأنه أن يؤدي إلى عمق تغلغل مختلف TIRF لإثارة موجات مختلفة. ونحن نعتقد أن هذه الآثار هي صغيرة لأن موجة زائل هو حقل تدهور بشكل كبير وعمق الميدان TIRF هي وظيفة خطية من الطول الموجي. وسوف Fluorophores على مقربة من سطح الزجاج تجربة لا فرق في شدة الليزر بين موجات اثنين. لfluorophores بالقرب من البولي ايثيلينعمق netration، فإن اختلاف كثافة يقدر بحوالي 1.3 أضعاف لموجات 2 488 و 640 نانومتر، وأضعاف 1.15 لموجات 2 488 و 561 نانومتر. ويمكن استخدام نفس النظام جنبا إلى جنب مع تقنيات فائقة أن قرار الاستفادة من الإضاءة TIRF.
وقد وصفت نحن أيضا نظام كاميرا 2 التي بنيت العرف. مثل نظام TIRF، أجهزة مماثلة كما تتوفر تجاريا. نظامنا يوفر مرونة لتغيير الفلاتر وdichroics، مما يتيح استخدامه مع مجموعات مختلفة من الموجات. العيب في نظامنا هو درجة واحدة من دوران اللازمة لتحقيق المواءمة بين الصورتين. يمكن حل هذه المشكلة باستخدام كاميرا المدرجات التي يقودها بيزو وتقدم درجة التناوب المحاذاة. لدينا أيضا بنجاح تنفيذ نظام الكاميرا اثنين على هذا المجهر، الذي الكاميرات مختلفة ولها أحجام مختلفة بكسل. ومن شأن مثل هذا النظام أن يكون مفيدا إذا كان أحد يحتاج الأمر إلى حساسية في قناة واحدة ودى كبيرمجموعة namic في بلد آخر، وكلاهما نادرا ما تتوفر في نفس الكاميرا. استخدمنا HQ-2 Photometrics كاميرا في binning 2X2 تعطينا حجم بكسل فعالة من 12.9 ميكرون مع الكاميرا كوانت-EM Photometrics التي لديها حجم بكسل من 16 ميكرون. تم استخدام أنبوب 180 مم البعد البؤري للعدسة EM-كوانت وتم استخدام أنبوب 145 ملم طول بؤري عدسة للكاميرا HQ-2. تمت السيطرة على HQ-2 باستخدام Metamorph البرمجيات وتمت السيطرة كوانت-EM عبر الصغرى مدير البرنامج على جهاز كمبيوتر مستقل في وضع الزناد الخارجية. وقدمت على الزناد خارجي الى الكاميرا كوانت-EM باستخدام الإخراج الرقمي من لجنة المساعدة الإنمائية مجلس قياس والحوسبة، والذي تم تنفيذه باعتباره مصراع إضافية في إعدادات الإضاءة من تكوين Metamorph. نسبة أطوال البؤرية من العدسات أنبوب يطابق نسبة من أحجام بكسل فعالة. ويرد محاذاة ممثل في الشكل 5.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا البحث من قبل شعبة البحوث ضمن الجدران من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعاهد الوطنية للصحة. ونحن ممتنون لHuppa يوهانس ومارك ديفيس لتزويدنا scFv من H57 المستخدمة في هذه الدراسات. وأود أن أشكر RV كير نيومان للمناقشة مفيدة خلال تطوير هذه التقنية.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Amaxa Nucleofector Kit for Mouse T cells | Lonza Inc. | VPA-1006 | |
PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit | Life Technologies | K2100-05 | For endotoxin free DNA preps |
Amaxa Nucleofector Device | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
Recombinant Murine IL-2 | Peprotech Inc. | 212-12 | |
Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm | Polysciences, Inc. | 24050-5 | |
Lab-Tek II 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific, Nunc | 155409 |