Procédure expérimentale: 1. Transfection en utilisant Amaxa souris des cellules T Nucleofector Kit Nous décrivons ici la transfection de naïf ou in vitro les lymphocytes T activés primaires avec des plasmides d'expression codant pour des molécules de signalisation marqués par la GFP, en utilisant la souris Amaxa cellules T Nucleofector Kit. In vitro d'activation de cellules T à l'aide de peptide-chargés APC spléniques est effectuée comme décrit avant 7. Toutes les cellules T utilisés dans nos études exprimer le TCR et qui reconnaît MCC peptide (88-103) lié à la molécule MHC IE k. La transfection est réalisée essentiellement selon les recommandations du fabricant, mais, nous présentons quelques conseils qui favorisent la viabilité des cellules T après la transfection. Les deux viabilité et l'efficacité de transfection est beaucoup plus élevé dans les in-vitro des cellules T activées que dans les cellules naïves. Avant de commencer, préparer 2 mL de milieu cellulaire T complété en ajoutant 20 pi deles deux composants du milieu A et B et 100 pi de sérum de veau foetal (5%) pour chaque transfection à effectuer. Équilibrer le milieu dans une plaque de 12 puits dans un 37 humidifié ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant au moins une heure. Alternativement, des aliquotes de milieu supplémenté avec 5% de sérum et le composant A peut être préparé et conservé congelé. Si tel est le cas, décongeler le nombre requis de parties aliquotes, ajouter la composante B, et de réaliser l'équilibration. – Pré-équilibrage du milieu est très important, comme la mort cellulaire se traduira par la remise en suspension des cellules après transfection dans un milieu qui est soit froid ou a un pH supérieur à 7,2 autre. Ensuite, préparer le mélange de transfection. Mélanger 82 uL de souris T Solution Nucleofector portable avec 18 uL du complément 2 et 5 ug d'ADN plasmidique (concentration non inférieure à 0,5 ug / ul). Mélanger soigneusement en appuyant sur le tube ou avec l'utilisation de micro pipette. -Il est important d'effectuer une titration de la dose plasmide pour un nombre fixe de cellules pour chaque construction doit être utilisé pour la transfection. Pour certaines constructions plus grandes, plus l'ADN peut être nécessaire. L'ADN devrait être libre d'endotoxines. Transfert de 5 à 10 millions de cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger à 600 tours par minute pendant 5 minutes à température ambiante. Retirez le maximum de surnageant que possible avec un aspirateur. – Les fabricants recommandent tourner les cellules à moins de 90x g; dans notre cas, cette vitesse correspond à 75x g. La force centrifuge relative choisie (RCF) pour obtenir un culot cellulaire est peut-être la variable la plus cruciale, que la centrifugation à RCF à faible prévient les dommages à la membrane cellulaire. Remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange de transfection par doucement et lentement pipetage le culot cellulaire jusqu'à ce qu'il n'y grosses touffes de cellules restantes. Cela peut généralement être réalisé par tout aspirant les cellules Tvec la pointe de la pipette pas plus de 3-4 fois. Avec une pipette, transvaser soigneusement la suspension dans une cuvette certifié Amaxa, assurant qu'il n'y a pas de bulles présentes. Cap de la cuvette. Sélectionner le programme Nucleofector X-001 sur le dispositif Nucleofector. Insérez la cuvette dans le support de cuvette Nucleofector et d'appliquer le programme sélectionné. – Après électroporation des cellules, il est préférable de les transférer immédiatement au milieu de culture pré-équilibrée. Les fabricants recommandent que les cellules soient maintenus dans le milieu Nucleofector pour une durée n'excédant pas 15 minutes. Apportez la cuvette et le pré-équilibrée, un milieu de culture entièrement complété à la hotte. Utilisation de la pipette en plastique fourni, ajouter environ 500 pl du milieu à la cuvette et transférer la suspension de cellules dans le milieu dans le goutte à goutte plaque. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 4 heures avant l'imagerie. Cellules naïves sont Incubated à 30 ° C au lieu de 37 ° C. Cela aide à maintenir leur réactivité à l'antigène. – Trois à quatre heures d'incubation sont généralement suffisantes pour les cellules T à détectable exprimer des protéines de la GFP marqués. Nous avons choisi de cellules d'image à ce point dans le temps parce que le niveau d'expression est faible et les artefacts de la sur-expression doit être minimisée. Si la sur-expression d'une protéine particulière est souhaitée, cependant, les cellules T doivent être retirés à partir du milieu Amaxa après 4 heures. Ceci est réalisé en plus pelletting les cellules à RCF bas et remise en suspension dans prééquilibrée support de culture cellulaire T supplémenté avec 50 U / ml de l'interleukine 2 (IL-2) à une densité de 2 millions de cellules par millilitre. 2. Microscopie TIRF Description de la microscopie TIRF: La configuration générale: composants optiques ont été construits autour d'un microscope à fluorescence Olympus IX71 qui a été à l'origine équipé d'un module Olympus FRBR. Nous nous sommes vite discovered effets chromatiques dans ce module quand un état d'alignement unique n'a pas obtenir une bonne collimation coïncide pour les lignes laser de différentes longueurs d'onde. Ce module, par conséquent, ne permettrait pas de la FRBR imagerie simultanée en utilisant des longueurs d'onde d'excitation différentes, et nous partîmes pour construire un appareil de mesure FRBR qui minimise les effets chromatiques dans le système, comme nous le verrons en détail dans les sections suivantes. La méthode décrite ici a été développé pour le grossissement 150 X, 1,45 ouverture numérique (NA) TIRFM objectif (Olympus), mais fonctionne aussi bien pour le grossissement 60 X, 1,45 versions NA. Pour l'éclairage à grand champ, le microscope est reliée à une source de lumière à halogénure métallique Lambda-XL et une roue à filtres d'excitation (instruments Sutter) munis de filtres d'excitation. Pour le positionnement automatique de l'étage d'échantillon par rapport à l'objectif, le microscope est équipé d'une traduction motorisé XY, piézo-Z contrôlée étape (ASI). Les images sont capturées en utilisant deux identiques Quantem de multiplication d'électrons (EM) caméras CCD (Photometrics). La taille de pixel de ces caméras se marie très bien avec le grossissement offert par l'objectif 150 X FRBR, qui donne une résolution finale de 0,1 um par pixel. Les caméras EMCCD offrons également la sensibilité de visualiser transfectants GFP ayant le niveau d'expression faible. Lasers: Pour la FRBR éclairage, un système de 5 lasers délivrant un total de 6 lignes laser (405 nm, 440, 488, 514, 561 et 640) est couplé dans une fibre monomode (Technologies Solamere). Le laser à l'argon et 561 nm diode à l'état solide pompé (DPSS) laser (488 lignes, 514 et 561) sont acheminés à travers une fibre acousto-optique accordable (AOTF) pour le contrôle d'intensité tandis que l'intensité des diodes laser (405, 440 et 640 nm) est commandé par modulation de la tension de leurs alimentations. La tension sur le AOTF et les alimentations des lasers à diode est contrôlé par une carte d'acquisition de données (CAD) conseil (Mesure Computing) en utilisant le logiciel MetaMorph (moléLAR Devices). Le rendement de couplage pour les lasers à diode est de 30% tandis que ceux des lasers Argon et DPSS sont environ 60% en raison de leurs petits diamètres de faisceau. FRBR module: Pour simultanément l'image de la TCR et de ses molécules de signalisation associées, telles que décrites précédemment, il était essentiel de disposer d'un éclairage TIRF qui a été corrigé et chromatiquement qui ne nécessiterait pas de réalignement ou de recentrage lors de l'acquisition d'émissions de fluorescence de différentes longueurs d'onde. TIRFM a été réalisé en utilisant travers l'objectif-éclairage, tel que décrit avant le 17. Le câble à fibres optiques qui fournit de la lumière laser pour le microscope est fixé dans un lancement de fibres munie d'un support de fibre XY monté sur un rail de micrométrique entraînée optique pour Z réglage (Thorlabs). Pour atteindre la FRBR éclairement, le faisceau laser est focalisé au niveau du plan focal arrière de l'objectif en utilisant un système de deux lentilles (L1 (lentille de collimation) et L2 (lentille de focalisation) dans la figure 1), de telle sorte que l'beam émerge collimaté sur l'objectif. Ce qui garantit que tous les rayons de lumière sortant de l'objectif ont le même angle par rapport au plan d'échantillon. La pointe de la fibre optique est positionnée au foyer de la lentille de collimation. En déplaçant le long du rail micromètre optique par rapport à la lentille de collimation (direction Z), il est possible de régler la focalisation du faisceau et déplacer le faisceau dans la position X et Y en utilisant les boutons de réglage XY. En raison de l'ouverture arrière très petit de l'objectif 150 X, nous avons constaté que pour atteindre la FRBR, la taille du spot laser au plan focal arrière devait être petite. Pour atteindre l'objectif nécessaire pour produire la petite tache, lentilles de courte focale sont nécessaires (Keir Neumann, communication personnelle); par conséquent, nous avons utilisé une lentille de focalisation avec une longueur focale d'environ 108 mm qui a été placé dans le cube dichroïque précédant directement l'objectif. La lentille de collimation a été placé plus près du séparateur de faisceau qui a introduit la TIÉclairement RF. Afin de minimiser les effets chromatiques indésirables, nous avons utilisé doublets achromatiques (lentille chromatiquement corrigées par des éléments fusibles lentilles deux fabriqués à partir de matériaux de différents indices de réfraction) avec des revêtements anti-reflets à la fois pour la collimation et de focalisation des lentilles (JML Optical). La mise au point peut être vérifiée en contrôlant que le faisceau collimaté émerge hors de l'objectif lorsqu'il est positionné dans le centre de l'ouverture arrière et devrait former une tache serrée sur le plafond de la salle. La position du point focalisé est ensuite déplacé vers le bord de l'ouverture (dans la direction Y) qui amène le faisceau à converger sur le plan d'image à grand angle, et éventuellement, l'angle critique de réflexion interne totale est obtenue. Utilisation ces composants optiques, on atteint une collimation simultanée de tous les longueurs d'onde de 442 à 640 nm au même alignement. Un alignement optique unique, donc, nous a permis d'effectuer TIRFM simultanément à travers de multiples longueurs d'onde. Appar Double caméraatut: l'acquisition simultanée de l'émission de fluorescence distinct provenant de deux fluorophores différents a été obtenue par construction d'un système à deux caméras qui divise l'émission en deux gammes de longueurs d'onde par l'utilisation de miroirs dichroïques (figure 2). La lumière émise est réfléchie par l'objectif à partir du port côté droit du microscope. Comme la plupart des objectifs sont corrigés à l'infini (avec les images formées à l'infini), une lentille de tube est nécessaire pour focaliser l'image. Pour manipuler deux longueurs d'onde d'émission simultanément, la lentille de tube sur le port côté droit a été supprimé. Un adaptateur personnalisé contenant monture C fils (Sutter Instruments) a été fixé et relié à un support de miroir dichroïque (Edmund optique). Miroirs dichroïques qui séparent l'émission GFP de celle de colorants organiques utilisés pour marquer le TCR (Alexa546, Alexa647, etc) ont été installés dans ce support. Ce module a été suivi dans les deux trajets de lumière par un titulaire de lentille de tube, un porte-filtre d'émission et de tubes d'extension. Lalentilles de tube (TL1 et TL2 (figure 2)) ont une longueur focale de 180 mm. Lacunes dans les tubes d'extension conduisant à des caméras CCD ont été EM recouvert de papier noir pour protéger les caméras de la lumière parasite. Pour permettre l'alignement des deux canaux, les caméras ont été montées sur les deux supports personnalisés de traduction XYZ (Produits Holmarc). Ci-dessous nous décrivons comment aligner le microscope pour deux canaux simultanés d'imagerie. Les étapes d'alignement sont l'éclairement FRBR, réglage de la puissance laser, et en alignant les deux images de sortie en utilisant des sous-résolution microbilles. Avant de commencer, tous les composants du microscope sont sous tension. L'ordinateur et le logiciel sont ensuite commencé et il est assuré que tous les composants matériels sont reconnus par le logiciel. Pour une utilisation en tant que norme co-localisation, diluer 1 pl de sous-résolution (0,2 um) Fluoresbrite Multi-microsphères fluorescentes dans 2 ml de PBS et ajouter 0,25 mL de la microsphèresuspension dans chaque puits d'un Lab-Tek II 8-bien chambré lamelle système (Nunc). Placez le système de glissière chambre sur la plate-forme au-dessus de l'objectif. Billes qui sont adsorbés sur le verre sont ensuite amenés dans le foyer. Utilisation de l'alignement Y sur le lancement de fibres XYZ, la position du faisceau laser est déplacé vers le centre de l'ouverture arrière de l'objectif. Il est important de le faire lorsque l'objectif est dans la position où l'avion de verre est au point. Si le faisceau n'est pas collimaté, le micromètre Z est ajustée pour obtenir une collimation intégral. La collimation est testé individuellement pour toutes les lignes laser pour être utilisés dans l'expérience. A ce stade, la puissance du laser pour chaque ligne est mesurée à l'aide d'un mètre la puissance du laser et est ajustée à 20-30 uW dans chaque canal. T-cellules sont extrêmement sensibles à un rayonnement laser, et l'éclairage est limité à un total de 50 uW. Images des billes sont acquises à l'aide FRBR éclairantionique en mode direct. Activer le micromètre Y-alignement sur la fibre de lancement afin que le faisceau commence à se déplacer loin du plafond jusqu'à son angle par rapport aux approches de l'objectif de l'axe optique de 90 degrés. Finalement, lorsque l'angle critique pour TIR est atteint, la lumière laser ne sera plus quitter l'objectif. L'alignement FRBR est alors jugé en se concentrant de haut en bas par le plan de la lamelle. Si billes qui flottent en solution peut être visualisée, alors l'angle du faisceau par rapport à des besoins objectifs normales à être augmenté. À l'alignement correct FRBR, un seul plan optique sera en focus (c.-à-, seules les perles qui sont adsorbés à la lamelle). Un test plus fine de l'alignement FRBR peut être mis en œuvre lorsque l'imagerie des cellules T colorées avec un colorant de surface qui se sont répandus sur une surface. (Voir le point 3.4). Après illumination FRBR a été atteint, les deux canaux peuvent être alignés par rapport à l'autre. Concentrez-vous sur les perles et de comparer la position de icaractéristiques dentifiable dans les images produites dans les deux canaux. Utilisation du X et Y vis micrométriques sur un support de la caméra, mettre la position relative des billes dans la proximité proche que possible. Enregistrez les images des deux canaux. Ces images seront utilisées en tant que norme co-localisation d'aligner les deux canaux. Les caméras doivent également être alignés de manière qu'ils sont parfocale par rapport à l'autre. Ceci est réalisé en acquérant une série d'images de les billes sous-résolution qui sont séparées les unes des autres dans la direction Z de 100 nm. Si le pixel d'intensité maximale pour des billes se trouve dans le même plan pour les deux des caméras, puis ils sont parfocale. 3. Imagerie Une fois que le microscope est mis en place, la tâche suivante consiste à préparer des chambres de flux contenant des bicouches lipidiques supportées en verre présentant molécules d'antigène et de l'adhérence comme décrit précédemment 6 et ensuite effectuer TIRFM des cellules T transfectées interagissant avec lesubstrat. La bicouche publié protocole 5-6 a été suivi, tel que publié, sauf que les liposomes ne sont pas mis à incuber pendant 20 minutes sur la lamelle après la chambre de circulation a été assemblé. Au lieu de cela, HBS-BSA tampon a été coulé dans la cellule d'écoulement immédiatement après l'assemblage. Assembler une chambre d'écoulement avec des bicouches lipidiques planes formées sur la lamelle de verre contenant du Ni-NTA lipides. Molécules d'adhésion, ICAM-1 (100 molécules / um 2), et des complexes peptide-CMH, MCC chargé IE k (5-10 molécules / um 2), sont incorporés dans la bicouche via leurs étiquettes histidine. La molécule co-stimulatrice CD80 est ajouté en utilisant un point d'ancrage GPI (100 molécules / um 2). Placez la cellule d'écoulement sur la scène du microscope et de le stabiliser. Fixez le fabricant fourni élément de chauffage, la cellule de flux pour contrôler sa température. Placez l'objectif sur une bicouche et amener le plan bicouche pour se concentrer. Activer chauffage de l'objectif et le fluxcellulaire pour stabiliser la température de la chambre à 37 ° C. Transfectées Les cellules T sont culottées au bout de 4 heures d'incubation à une vitesse de 80x et g re-suspendu dans HBS-BSA tampon et complété avec 10 ug / ml de H57 Fab ou 20 pg / ml de H57 fragment de chaîne variable unique (scFv) à étiqueter le TCR. Les cellules sont ensuite injectés dans les cellules d'écoulement. L'imagerie est fait dans la présence continue de la Fab ou scFv en raison de leur haute constante de dissociation. Leur présence dans le milieu n'augmente pas significativement le fond comme sur le terrain FRBR est très mince. Conditions d'imagerie sont mis en place afin que l'acquisition de deux canaux en direct montre un aperçu en direct des chaînes de TCR et la GFP qui aide à la recherche de cellules transfectées. FRBR éclairage est confirmée en mettant l'accent en place le plan de verre afin de détecter toute coloration de la membrane latérale. Si les membranes latérales ne viennent pas au point, puis l'alignement FRBR est bon. Les cellules transfectées sont ensuite imagé une fois ou dans une séquence d'image pour produire videos. 4. Traitement de l'image et l'analyse des données Le logiciel génère des images des deux caméras dans un cadre unique. La sortie de chaque appareil est de 512 x 512 pixels, d'où l'image de sortie est de 1024 x 512 pixels. Les images doivent d'abord être divisé en trames individuelles correspondant aux deux caméras. Les images de l'Afrique sub-résolution perles dans les deux canaux sont revêtus et les paramètres d'alignement sont déterminés. Une caractéristique spécifique à notre système est une rotation de 1 degré d'un canal par rapport à l'autre (voir figure 3). La source la plus probable de cette rotation est des stands de caméra. Après cette rotation en outre par rapport à des transformations linéaires X et Y ont besoin d'être effectuée à aligner parfaitement les billes par rapport à l'autre. Images de perles sont obtenus dans chaque expérience afin de déterminer les paramètres précis pour aligner les deux canaux. Ces transformations linéaires et de rotation sont ensuite appliqués à tous lesimages et puis ils sont soumis à des algorithmes de segmentation et la co-localisation d'analyse. 5. Les résultats représentatifs Le système décrit ici peut être adapté pour étudier de signalisation en aval de n'importe quel récepteur à la membrane plasmique. Il est particulièrement instructif d'étudier signalisation du TCR, car la signalisation se produit dans les grappes optiquement résolus appelés TCR microamas ou dans les endosomes comme l'a récemment décrit 18. Si la signalisation a eu lieu en Afrique sub-résolution des grappes de récepteurs ou d'ONU-cluster récepteurs expériences supplémentaires devront être prises pour interpréter les données. Comme mentionné précédemment, les chaînes CD3 du complexe TCR subissent une phosphorylation par la kinase de la famille Src Lck lors de l'engagement du TCR par des complexes peptide-CMH. La chaîne CD3ζ phosphorylée recrute alors le kinase de la famille Syk ZAP70. Visualisation du recrutement de Zap70 rapporte donc sur l'état de phosphorylation de la chaîne CD3ζ. La force de stimulation du TCR peut être modifié en utilisant des peptides mutés à des résidus de contact TCR. Ces peptides sont appelés ligands peptidiques modifiés (APL). Une expérience représentative est illustré à la figure 4, où les peptides agonistes recrute robuste ZAP70 à microamas TCR tout en bas de la puissance peptide T102L ne parvient pas à recruter ZAP70 à TCR microamas, démontrant que la chaîne CD3ζ n'est pas phosphorylée dans ce cas. Nous pourrions tirer cette conclusion parce que nous avions à se contenter d'observer le recrutement de ZAP70 aux clusters TCR qui ont été facilement détectés par TIRFM. Un algorithme de segmentation automatique a été utilisée pour compter le nombre de ZAP70 microamas par cellule. On voit également dans le film supplémentaire est l'imagerie simultanée de TCR et ZAP70 fluorescence associée. Notez la nature dynamique de lamelipodium. <br /> Figure 1. Image et schématique du lancement personnalisée FRBR. Le panneau A montre la photographie du lancement FRBR tel qu'il est installé sur le microscope, et le Groupe B est une vue schématique du lancement FRBR démontrant le chemin de lumière. Le schéma et d'image indiquant la position de la lentille de collecteur, le diviseur de faisceau, le lancement de fibres avec X, Y et Z ajustements, l'lentille de collimation L1 et la lentille de focalisation L2 installé dans le cube dichroïque et l'objectif FRBR. L'encart montre la lentille de focalisation installé dans le cube dichroïque. Figure 2. Image et schématique du système de deux caméras. Le panneau A montre la photographie du système à deux caméras tels qu'ils sont joints au microscope, et le Groupe B est une vue schématique de la même chose. Le schéma et l'image montre la position de l'objectif, miroir, dichroïque, lentilles de tube TL1 et TL2, l'émission filtres F1 et F2, les deux caméras C1 et C2 sur théritier est avec leur X respective, Y et Z des ajustements. Figure 3. L'utilisation de sous-résolution perles pour aligner les deux canaux. Les panneaux A et B montrent des superpositions de sous-résolution perles avant (partie A) et après (Groupe B) l'alignement. Panneau Un montre que l'un des canaux est tourné par rapport à l'autre. Les panneaux C et D sont un sous-section des images en A et B. Groupe E montre une image à deux canaux de superposition de cellules sans traitement. Paramètres d'alignement utilisés dans le panneau D ont été appliqués à l'image affichée dans le panneau de F. Remarquez comment l'lamelipodium des deux canaux est parfaitement aligné dans le panneau F et non pas dans le panneau de E. La barre d'échelle 4 um pour tous les panneaux. Figure 4. ZAP70 recrutement TCR microamas en réponse à différentes mines terrestres antipersonnel. In vitro activé ET T cellules ont été transfectées avec un plasmide codant pour ZAP70 fusionnée à la GFP et ont été incubées sur verre soutenus par Ni-NTA bicouches contenant 6 molécules / um 2 du peptide chargé His-tagged-IE k, 100 molécules / um 2 de Alexa647 conjugué His-tagged ICAM- 1 et 100 molécules / um 2 de GPI-ancrées CD80. Les peptides chargés sont indiquées dans l'encadré. ICAM-1 se réfère à des cellules sur bicouches contenant 100 molécules / um 2 de Alexa-647 conjugué étiquette His ICAM-1. Dual channel acquisition simultanée microscopie TIRF a été réalisée en la présence continue de Alexa546 conjugué H57 fragment Fab (non bloquant) pour colorer le TCR. Les cellules ont été imagées jusqu'à une heure après le contact initial avec la bicouche. Numéros de ZAP70 grappes par cellule ont été analysées en utilisant un logiciel de cluster automatisé de comptage. Au moins 40 cellules ont été analysées dans chaque cas. Échelle de la barre 2 um pour toutes les images. 92/3892fig5.jpg "/> Figure 5. Alignement du système à deux caméras en utilisant deux différents types de caméras. Ce panneau montre la superposition de sous-alignés résolution perles imagée en utilisant le système à deux caméras, où les deux appareils ont des tailles de pixel différentes (vert: taille pixel de 6,45 um imagée à binning 2×2 et Rouge: taille 16 pixel um imagé sans binning). Encart montre la vue agrandie de la boîte carrée dans le centre du champ. Échelle de la barre 5 um. Film supplémentaire. ZAP70 recrutement microamas TCR en réponse au peptide agoniste. In vitro des cellules T activées et ont été transfectées avec un plasmide codant pour ZAP70 fusionnée à la GFP et ont été incubées sur verre soutenus par Ni-NTA bicouches contenant 6 molécules / um 2 du peptide chargé His-tagged-IE k, 100 molécules / um 2 de Alexa647 Son conjugué des molécules étiquetées ICAM-1 et 100 / um 2 de GPI-ancrées CD80. Dual channel simultanée unecquisition TIRF microscopie a été réalisée en la présence continue de Alexa546 conjugué H57 fragment Fab (non bloquant) pour colorer le TCR. Un champ de cellules transfectées a été maintes fois imagé 40 fois avec une résolution temporelle de 10 secondes par image. Échelle de la barre 2 um. Cliquez ici pour voir le film supplémentaire .
