بروتين منخفض الوزن الجزيئي تخصيب اليورانيوم على أفلام السيليكا Mesoporous رقيقة لاكتشاف العلامات البيولوجية
Summary
قمنا بتطوير تكنولوجيا تقوم على فيلم السيليكا mesoporous رقيقة لاستعادة انتقائي من البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي والببتيدات من مصل الدم البشري. تم ضبطها بدقة الخصائص الفيزيائية والكيميائية للرقائق لدينا mesoporous لتوفير التحكم ملموسا في مجال تخصيب الببتيد وبالتالي لمحة بروتيوم المصل لأغراض التشخيص.
Abstract
تحديد المؤشرات الحيوية تعميم يحمل إمكانات كبيرة للنهج غير الغازية في التشخيص المبكر والتشخيص، وكذلك لرصد كفاءة العلاج. 1-3 وتداول منخفض بروتيوم الوزن الجزيئي (LMWP) يتكون من بروتينات صغيرة تسلط من الأنسجة والخلايا أو ارتبط شظايا الببتيد المستمدة من تدهور بروتين أكبر من البروتينات، ويعانون من هذه الحالة المرضية لدى المرضى، ويعكس على الأرجح في حالة المرض. 4،5 وعلى الرغم من هذه التطبيقات السريرية المحتملة، واستخدام الطيف الكتلي (MS) لمحة عن LMWP من السوائل البيولوجية وقد ثبت أن تكون صعبة للغاية نظرا لمدى ديناميكية كبيرة من تركيزات البروتين والببتيد في مصل الدم. 6 بدون عينة قبل المعالجة، وبعض من البروتينات أكثر وفرة عالية تحجب كشف منخفضة وفرة الأنواع في المصل / بلازما. البروتين الحالي القائم على النهج، مثل ثنائي الأبعاد بولكرلميد هلام شرمectrophoresis (2D-PAGE) والبروتيوميات بندقية الأساليب كثيفة العمالة، والإنتاجية المنخفضة وملاءمة العرض محدود بالنسبة إلى التطبيقات السريرية. 7-9 وبالتالي، هناك حاجة إلى استراتيجية أكثر فعالية لعزل LMWP من الدم، والسماح للفحص إنتاجية عالية من العينات السريرية .
هنا، نقدم سريعة وفعالة وموثوق بها متعددة تجزئة النظام القائم على رقائق السيليكا mesoporous خصيصا لاستهداف وإثراء LMWP. ملفقة 10،11 Mesoporous السيليكا (MPS) الأغشية الرقيقة مع ميزات الانضباطي في النانومترية الحجم باستخدام القالب كوبوليمر مسار triblock . باستخدام القوالب البوليمر المختلفة وتركيزات البوليمر في حل السلائف، تم تحديد مختلف توزيعات حجم المسام، والهياكل المسام، والاتصال والخصائص السطحية وتطبيق انتقائي للانتعاش من البروتينات كتلة منخفضة. إعراب الانتقائي للالببتيدات المخصب إلى أقسام فرعية مختلفة وفقا لخصائصها الفيزيائية والكيميائية سوف ENهانس كفاءة استرداد والكشف عن وفرة الأنواع منخفضة. بالاشتراك مع مطياف الكتلة والتحليل الإحصائي، أثبتنا العلاقة بين الخصائص nanophase من الأفلام السيليكا mesoporous رقيقة وخصوصية وفعالية من انخفاض الكتلة الحصاد بروتيوم. عرض نتائج الكشف عن هذه الوثيقة من إمكانات تكنولوجيا النانو القائم على توفير بديل قوي على الأساليب التقليدية للحصاد LMWP من السوائل البيولوجية المعقدة. وبسبب القدرة على ضبط خصائص المواد، والقدرة على الإنتاج منخفضة التكلفة، وبساطة وسرعة جمع العينات، ومتطلبات عينة تقلص إلى حد كبير للتحليل، وهذا سوف يؤثر بشكل كبير رواية تكنولوجيا النانو في مجال البحث العلامات البيولوجية البروتين والبروتين السريرية التقييم.
Protocol
Discussion
أدلة متزايدة على أن انخفاض الوزن الجزيئي منطقة بروتيوم الدورة الدموية هو مصدر غني من المؤشرات الحيوية التشخيصية للكشف المبكر عن المرض. في هذه التكنولوجيا، وقدمنا سلسلة من رقائق السيليكا mesoporous مع مختلف أحجام المسام، والهياكل المسام والتعديلات لتخصيب انتقائية الببتيدات والبروتينات منخفضة الوزن الجزيئي. لتقييم استقرار البروتين، وحضنت رقائق MPS مع مصل الدم البشري، تجفف بعد غسلها، وتخزينها ل3wk في درجة حرارة الغرفة. وكانت أنماط بروتين / الببتيد التي تم الحصول عليها مقارنة مع تلك من المصل مجزأة طازجة (الشكل 6A)، وهو ما أكدته نتائج التحليل الإحصائي وأظهرت 6B في الشكل. ويقدر تباين إشارات ذروة تقاس السيرة الذاتية في المتوسط 12.7٪ لمصل الخام وعلى 14.2٪ للعينات مجزأة. يمكن للاختلافات هامشية يكون نتيجة لتقلبات داخلية وثيقة MALDI واقترح أن سولم N-رقاقة المعالجة والتخزين لا تحدث أي تغيير كبير في ملامح البروتين MS. وقد أجريت نفس التجربة على السيليكون غير مسامية. كان المصل المجفف عافيتها بعد التخزين على سطح السيليكون مجزأة على رقائق MPS قبل تحليل MALDI. حصلت على الملف MS الفقراء أظهرت ميزة استقرار سطح mesoporous. في المقارنة مع آليات افترض سابقا، ونحن نفترض أنه تم الحفاظ على الأنواع LMW المحاصرين داخل nanopores من التدهور من خلال استبعاد حجم البروتياز، أو عن طريق تثبيط نشاط بروتين من الفراغية بها في مكان ضيق من nanopores. يمكن للطريقة القائمة على رقاقة MPS أن تكون أداة قوية في الببتيد وLMW التنميط بروتين معقد من الدراسة السوائل البيولوجية. رقائق MPS هي غير مكلفة لتصنيع والسماح للإنتاج الارتقاء بها لتحقيق المعالجة في وقت واحد من عدد كبير من العينات، وتوفير ميزات مفيدة للفحص استكشافي والبيولوجيةاكتشاف علامة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من جانب التحالف من قبل جائزة مركز NanoHealth (W81XWH-11-2-0168) وتكساس مركز للطب النانوي السرطان (1U54CA151668-01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Tetraethoxysilane | Sigma-Aldrich | 131903 | 98% |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Plasma Asher | Nordson March | AP-600 | |
| Spectroscopic Ellipsometer | J. A. Woollam Co. | M-2000DI | |
| MALDI-TOF | Applied Biosystems | Voyager-DE-STR | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich Co. | C8982 | Matrix for MALDI-TOF |
| trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich Co. | 85429 | Matrix for MALDI-TOF |
| Stir hot plate | Thermo Scientific | 11-475-30Q | |
| CultureWell chambered coverglass | Sigma-Aldrich | GBL103350 | 3 mm diam. ×1 mm depth, 3-10 μL, sterile |
| Pluronic F 127 | BASF | PEO106-PPO70-PEO106 | |
| Pluronic L121 | BASF | PEO5-PPO70-PEO5 | |
| Pluronic P123 | BASF | PEO20-PPO70-PEO20 |
Table 1. Physico-chemical properties and designed concentrations (Molecular weight and Iso-electric point) of the selected peptide and protein standards.
References
- Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. Proteomic applications for the early detection of cancer. Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).
- Etzioni, R. The case for early detection. Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers. Nature. 452, 571-579 (2008).
- Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. Clinical proteomics: written in blood. Nature. 425, 905-905 (2003).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, . A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics. Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).
- Rabilloud, T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics. 2, 3-10 (2002).
- Hu, Y. Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein. ACS Nano. 4, 439-451 (2010).
- Bouamrani, A. Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome. Proteomics. 10, 496-505 (2010).
