חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

1. ייצור שבב יצירת פתרון ציפוי שבב ידי הפעלת פתרון מבשר הידרוליזה סיליקט. ערבבו 14 מ"ל של tetraethylorthosilicate (TEOS) עם 17 מ"ל של אתנול, 6.5 מ"ל מים deionized ו 0.5 מ"ל של 6M HCl תחת ערבוב חזק (1,200 סל"ד) באמצעות מערבבים בצלחת חמה. מחממים את הפתרון הזה על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, תוך ערבוב מתמיד. להכין פתרונות פולימר ידי הוספת הרצוי תלת גוש coploymer (pluronic F127, L121 ו P123) ל 10 מ"ל של אתנול בטמפרטורת החדר עם ערבוב חזק. השלם את התערובת על ידי הוספת 7.5 מ"ל של תמיסת סיליקט (משלב 1.1) לתוך תמיסה תלת גוש קופולימר ואחריו 2 שעות של ערבוב חזקים בטמפרטורת החדר. זה מייצג את פתרון הציפוי הסופי. החל 1 מ"ל של תמיסת ציפוי סיליקון ופל 4 סנטימטר ציפוי ספין בקצב של 1500 סל"ד למשך 20 שניות. ואז החום על 80 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. מחממים את הסרטים להסיר סו אורגניrfactant על ידי העלאת הטמפרטורה 1 ° C לדקה עד 425 מעלות צלזיוס ולאחר מכן אופים במשך 5 שעות. Pretreat סיליקה mesoporous (MPS) שבב פני השטח עם חמצן פלזמה ashing (פלזמה אשר – מרץ פלזמה המערכת). (O 2 קצב הזרימה: 80 SCCM, עוצמה: 300 וואט, זמן: 10 דקות). משטח אופציונלי שינוי כימי: שבבי silanate ב organosilane 3% מתנול: מים די (19:01) הפתרון במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר תיבה 2 הכפפה N. יש לשטוף ברצף עם מתנול ומים די. לרפא שבבי ב 110 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בתנור מאוורר המופעל. 2. דוגמה לטיפול מקדים הוסף TFA ו ACN מדגם זה סרום כך הריכוזים הסופיים הם TFA 0.01% ו ACN 5%. מערבולת לערבב. ללחוץ את אלה דוגמאות על השולחן מערבולת שאכר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. 3. הסרום ההיפוך חלוקה מראש ואופים שבבי במשך הלילה בתנור על 160 מעלות ג לחלופין, storדואר השבבים ב תא ייבוש עד מוכן לשימוש כדי למנוע לחות על פני השטח על ידי מים הסביבה באוויר. השתמש באוויר דחוס כדי לנער את האבק כל החלקיקים עשויים להיות על פני השטח של השבבים. גזור טרומיים, רכשה CultureWell מחולק לתאים coverglass לכלול את המספר הרצוי של וולס. Coverglass נקי עם אתנול 100% ולאחר מכן מקום על פני השבב MPS. לחץ coverglass למטה עם מלקחיים כדי להבטיח חותם שלמה עם שבב. פיפטה 10 μL המדגם סרום לתוך מ"מ 3 כל טוב. דגירה של 30 דקות בחדר humidified בטמפרטורת החדר. פיפטה את הסרום מבארות וזורקים. פיפטה 10 μL מים deionized זה טוב כדי לשטוף חלבונים גדולים יותר. חזור על 4 פעמים. פיפטה 5 elution חיץ μL (0.1% + TFA ACN 50%) מדגם זה היטב. פיפטה למעלה ולמטה 30 פעמים תוך כדי תנועה את קצה פיפטה סביב הבאר לערבב את מאגר elution. (רק כדי להחיל חיץ elution 1-2 דגימות בכל פעם כדי למנוע חיץ elutionמ מתאדים כל כך מהר). לאחר ערבוב, פיפטה כל חיץ elution ומכניסים צינור microcentrifuge עד מוכן לבצע MALDI-TOF ניתוח. על מנת לחקות את המורכבות של מדגם ביולוגי להעריך את השפעת ההעשרה קצירת נמוך המינים משקל מולקולרי עם המערכת על שבב חלוקה, בחרנו והתכנסו תערובת רגילה של חלבונים ופפטידים ספירת 20 ושישה מינים שונים עם רחב מגוון של משקלים מולקולריים (900-66 500 Da) ו Pis (4.0-10.2) וריכוזים (0.5-8 pmol / μl) (ראה רשימת חלבון טבלה 1). 4. MALDI-TOF ניתוח של פפטידים 0.5 במקום μL המדגם לצלחת היעד MALDI ולאפשר לו להתייבש. 0.5 במקום מטריקס μL (α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA), 5 גר '/ ל') או פתרון רווי של חומצה טרנס ,5-3-4-dimethoxy hydroxycinnamic (SA) ב אצטוניטריל 50% המכיל 0.1% TFA ו מאפשרים גיבוש משותפת. </ Li> 0.5 במקום μL של פתרון כיול למקום כל כיול ולאפשר לו להתייבש. הכנס לתוך צלחת היעד ספקטרומטר MALDI-TOF המוני. המכשיר צריך להיות מוגדר מצב המשקף חיובית בעוצמה לייזר של 4200 ו 3000 יריות לדגימה. טווח המוני הנבחר צריך להיות 800-5000 Da בעל מסה יעד של 2000 Da. ביצוע ניתוח זהה MALDI-TOF במצב ליניארית, אלא לשנות את טווח המונית 900 ל 10,000 Da או 3000 ל 70,000 Da ואת המוני היעד של 5000 Da. 5. ניתוח נתונים ספקטרום גלם עובדו באמצעות תוכנת ConvertPeakList והנתונים יוצאה SpecAlign תוכנות העיבוד המקדים. ספקטרום כולם מיושרים בשיטת קורלציה PAFFT ואת עוצמות היו מנורמל ל הנוכחי יון הכולל (עוית) בספקטרום בכל המקביל. ספקטרום כולם מוחלק דה השמיע עם מקדם של 4 ו -0.5 בהתאמה. פסגות התגלו עם הבסיס של החלון, 0.5 המונית של 21 וגובהיחס 1.5, ערכים שליליים הוסרו לפני ניתוח. אשכולות היררכי בוצעה באמצעות Cluster 3.0 ו דמיינו עם תוכנת MapleTree. MALDI MS נתונים (M / Z לעוצמות השיא) היה יומן שינה, נורמלי, ומאוזן החציוני. מתאם פירסון היה להשתמש כדי לחשב את המרחק בין הדגימות, ו אשכולות הצמדה מלאה בוצעה. סטודנט עצמאית מבחן t שימש השוואה בין קבוצות (n = 2 קבוצות) לכל אחד זוהה MS שיא לקראת ניתוח אשכולות היררכי ללא השגחה. P-value של 0.02 או נמוך יותר נחשב משמעותי כדי לבחור פפטידים וחלבונים שנקטפו דיפרנציאלי בין שבבים שונים proteomic mesoporous (נקבוביות גדולות לעומת נקבוביות קטנות). 6. נציג תוצאות כפי שניתן לראות בתרשים 1, במחקר זה אנו מפוברק סדרה של סרטים סיליקה mesoporous דקים עם מגוון רחב של nanotextures ומקיף בחנושימוש ב IR סלקטיבית לכידת ומעשירה LMW פפטידים וחלבונים מן בסרום אדם. איור 2 א 'וב' להראות ספקטרום MS המדגם סרום מעובד על פפטידים בטווח של 900 עד 10,000 דא ועל חלבונים בטווח של 3000 ~ 70,000 דה בהתאמה . ספקטרום אלו ממחישות את דיכוי האות באזור LMW בשל נוכחותם של מיונן היטב במשקל, בהיקף נרחב ביותר מולקולרי גבוה (HMW) חלבונים כגון אלבומין. איור 2 ג ו – ד מתארים ספקטרום MS מדגם בסרום לאחר חלוקה של L121 MPS (גודל הנקבוביות, 6 ננומטר). הרוב של מולקולות גדולות כבר מדולדל, וכתוצאה מכך העשרת משמעותית של רכיבי LMW. כמו פקד, מדגם בסרום אותו נמרח על פני השטח סיליקה nonporous טהור להעריך את הספציפיות של סרטים דקים של MPS להתאוששות LMWP. כפי שניתן לראות באיור 2e ו-F, לא היה קציר משמעותי של PEPגאות או חלבונים מן סיליקה nonporous. לכן ניתן להסיק שמדובר באדריכלות mesoporous ולא את פני השטח סיליקה זיקה המהווה גורם הרוב בקהילה להעשרת LMWP. וריאציות שבשליטת דווקא גודל הנקבוביות ניתן להשיג באמצעות קופולימרים עם אורכים שונים לחסום הידרופובי. באמצעות חלבונים המיועדים תערובת פפטידים, ההשפעה של גודל הנקבוביות על פפטיד LMW והתאוששות יעילות החלבון נחקר באמצעות MPS סרטים דקים שהוכנו מארבעה פעילי שטח Pluronic (F127, P123, L121, L121 ו בתוספת סוכן נפיחות) עם יחס נפח שונות המרכיבים הידרופילי ו הידרופובי כדי ליצור גדלים הנקבוביות של 3.7 ננומטר ננומטר, 5.2, 7.4 ו 9.0 ננומטר ננומטר בהתאמה. זה מגוון של גדלים הנקבוביות הובילה להתאוששות של רפרטואר שונה של פפטידים וחלבונים מן המדגם סרום אותו באמצעות גודל והרחקה הצורה (איור 3). ספקטרום חלבון גבוהה משקל מולקולרי דemonstrate מולקולרית חתוכים מכל סוג של שבב. בנוסף דלדול תלוי בגודל של חלבונים HMW, חלוקה על שבב של פתרון תקני מציג ההפרש והעשרה סלקטיבית של מינים LMW הקשורים הגדלים הנקבוביות. אשכולות דו כיווני היררכי מוצג איור 3 ב מציג את דפוס סטנדרטים LMW העשרה שהושג עם MSC שונה. גם אם כל פפטידים הם מתחת מולקולרית חתוכים של צ 'יפס, יש מתאם חיובי בין גודל הנקבוביות משקל מולקולרי של המין הלכודים. MSC עם נקבוביות גדולות, עד 9 ננומטר, מעדיפים לקצור פפטידים גדולים יותר, ואילו פפטידים קטנים יותר הם התאוששו בצורה יעילה יותר על ידי צ 'יפס עם נקבוביות קטנות יותר. השינוי המבני של ההסדר mesoporous בוצע על ידי כוונון הריכוז של הפולימר התבנית. הגדלת הריכוז של הפולימר תבנית הביא עקמומיות interfacial מופחת בין השלביםמים, קופולימר, ואת סיליקט, וכתוצאה מכך ליזום התקדמות בזה מן כדורי מבנה גלילי. Pluronic F127, עם משקל מולקולרי גבוה, בעל רמה גבוהה זו של מחזוריות מבנית. על ידי הגדלת ריכוז F127 בהפעלת פתרון שונים של MPS ננו סרט דק תקופתיים ניתן לקבל nanostructure 3D כדי nanostructure 2D. ננו 3D משושה מעוקבים ו חלת דבש, בעל interconnectivity nanopore נחשק יותר ומורפולוגיה nanopore נגיש יותר, מפגינים ביצועים מעולים סלקטיבי להעשיר פפטידים LMW מאשר מבנה משושה 2 ד, אף על פי שהם דומים לחלוק הפצות גודל הנקבוביות מולקולריים באותו חתוכים עבור סרום חלוקה (איור 4). אנחנו יעיל גם נטיה של אורגנו, silane על שבבים של MPS על ידי החדרת חמצן פלזמה ashing כדי pretreat משטח השבב. על מנת ללמוד את השפעת איכותית אלקטרוסטטי על בחירהive על שבב העשרה, אנו משתמשים את החלבונים לתערובת פפטידים. ניתוח MS של פתרון תקני proteomic מופרדים על שבבים של MPS שהוכנו עם L121 ו מצומדות עם קבוצות פונקציונליות כימיים מוצג באיור 5. חיובי ו מטען שלילי פפטידים וחלבונים LMW נלכדים על anionic ואת שבבי קטיוני בהתאמה. השוואה כמותית של שבבים של MPS מרובים לשחזר את פפטידים עם תשלום נטו חיובי מוצג ציור 5a. צ 'יפס עם מטען שלילי ואת שבבי ללא כל שינוי (עם מטען שלילי קטן במקור) התערוכה העשרה גבוה באופן משמעותי עבור אותם פפטידים מאשר שבבי שונה עם APTES (-NH 2). לעומת זאת, את שבבי בעלי מטען חשמלי חיובי של MPS בעל יכולת יוצאת דופן לשחזר אותם פפטידים עם מטען נטו שלילי, כאשר הפגינו איור 5 ב '. בעוד α-האנדורפין אינו מראה ד שינוי משמעותיUE כדי לצרכן סביב 6. באיור 1. עקרון חלוקה שבבי MPS והעשרה LMW. לאחר תצפית מדגם על פני השטח, חלבונים ופפטידים LMW לכודים בתוך הנקבוביות, בעוד מינים גדולים נשארו מחוץ הנקבוביות ואת יוסרו במהלך השלבים כביסה. שברים המועשר הם eluted אז ונותחו על ידי MALDI. איור 2. העשרה פפטיד באמצעות mesoporous סיליקה דקים שבבי הסרט. MALDI טרשת נפוצה פרופילים טווח הן מסה נמוכה (900-10 000 דה) ואת טווח מסה גבוהה (3000-70 000 דה) לפני (a, b) ואחרי עיבוד (C, D) בסרום על הסרטים סיליקה mesoporous דקים ( L121, 6 ננומטר). שחזור מולקולרית מצטמצם משמעותית כאשר באמצעות משטחים ריקים סיליקה nonporous (E, F). <img alt="איור 3" src="/ Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg" /> איור 3. העשרה חתך וגודל תלוי מולקולרית של שבבים של MPS. (א) תצוגה מוגדלת של הספקטרום MALDI הוכחת המולקולרי המאפיין חתוכים של כל השבבים של MPS התאמת גודל הנקבוביות. (ב) אשכולות דו כיוונית היררכי של תכונות לערבב פפטיד בין שבבים שונים. עוצמת צבע אדום או צהוב עולה ריכוז הפפטיד יחסית. נקבוביות גדולות יותר משופר קצירת של פפטידים גדולים יותר (3600-8500 Da), בעוד פפטידים קטנים (900-3500 Da) נמצאו מעדיפים מן שבבי עם נקבוביות קטנות יותר. איור 4. אפיונים פיזיים של שכבות דקות של MPS ושחזור סלקטיבית עם ננו שונים. XRD תבניות (A, B, C), TEM (הבלעה, B, C), Pluronic F127 בריכוזים שונים בתמיסה מבשר: 4.0 ×10 מ -3 (א), 6.0 × 10 -3 M (ב), ו -8.0 × 10 מ -2 (ג). (ד) בר גרף של עוצמת גילוי הממחישות את ההתאוששות פפטידים סלקטיבית על מעוקבים 3D ו 3D F127 שבבי משושה proteomic (גור ו הקס, בהתאמה). על שינויים מבניים שונים להציג העשרה סלקטיבית. איור 5. תשלום מסוים התאוששות עבור צ 'יפס עם פונקציות שונות על פני השטח. בר גרף של עוצמת MS של גילוי פפטידים שנתפסו באופן סלקטיבי על שבבי פונקציונליות. על פי טענתם ISO-חשמלי, פפטידים הם באופן חיובי או מטען שלילי ב-pH 7.0. (א) חיוביות (פפטידים (1) des-Arg1-Bradykinin, (2) Bradykinin, (3) חומר P-אמיד, (4) Neurotensin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 – 38)) מועשרים במיוחד על sur מטען שליליפרצופים. (ב) (פפטידים שליליות (7) Glu1 fibrinopeptide-B, (8) α-אנדורפין, (9) אינסולין ACTH (18-39), (10), (11) EGF, (12) דמוי אינסולין GFII) הם מועשר במיוחד על משטחים בעלי מטען חשמלי חיובי. איור 6. על שבב ייצוב סרום מופרדים. (א) נציג פרופילים MALDI של פפטידים וחלבונים LMW eluted מיד לאחר חלוקה בסרום (למעלה) או אחרי 3 WK של אחסון על גבי שבב בטמפרטורת החדר (למטה). (ב) מלמעלה למטה: ניתוח רגרסיה ליניארית של עוצמות הממוצע של שזוהו פסגות לטרשת נפוצה לשכפל כל לעומת לשכפל 1 עבור מופרדים טרי בסרום מופרדים בסרום לאחר אחסון שבבי MPS 3wk בטמפרטורת החדר. , משוואה קורות חיים מקדם הקביעה (R 2) מצוינים.