نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية
Summary
المتفطرة السلية تشكل الأغشية الحيوية المخدرات متسامح عندما تربيتها في ظروف معينة. نحن هنا وصف أساليب لزراعة M. الأغشية الحيوية والسل، وتحديد وتيرة صوامد المخدرات متسامح. وهذه البروتوكولات أن تكون مفيدة لمزيد من الدراسات في آليات التسامح المخدرات في م. مرض السل.
Abstract
المتفطرة السلية، وكيل خاص بأسباب الأمراض من مرض السل البشري، لديه قدرة غير عادية على البقاء على قيد الحياة ضد الضغوط البيئية بما فيها المضادات الحيوية. على الرغم من تحمل الإجهاد من م. مرض السل هو واحد من المساهمين على الأرجح إلى العلاج الكيميائي لمدة 6 أشهر طويلة من مرض السل 1، والآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا النمط الظاهري مميزة من مسببات المرض لا تزال غير واضحة. لقد تطورت الأنواع الجرثومية العديد من البقاء على قيد الحياة في البيئات المجهدة عن طريق تجميع الذاتي في السطح، ودرجة عالية من التنظيم المرفقة، وهياكل مصفوفة مغلفة تسمى الأغشية الحيوية 2-4. النمو في المجتمعات ويبدو أن استراتيجية البقاء على قيد الحياة المفضل للميكروبات، ويتحقق من خلال المكونات الجينية التي تنظم مرفق السطح، والاتصالات بين الخلايا، وتجميع المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) 5،6. ومما يسهل على الأرجح إلى التسامح الإجهاد البيئي من قبل العائد على السهم، وربما من قبل physiological التكيف من عصيات الفردية لmicroenvironments غير متجانسة ضمن بنية معقدة من الأغشية الحيوية 7.
في سلسلة من الأوراق الأخيرة التي أنشأنا م. والسل، واللخنية المتفطرة لديها ميل قوي للنمو في هياكل متعددة الخلايا المنظمة، ودعا الأغشية الحيوية، والتي يمكن أن تحمل أكثر من 50 أضعاف الحد الأدنى من تركيز المثبطة من الأدوية المضادة للسل الإيزونيازيد والريفامبيسين 8-10. م. مرض السل، ولكن يتطلب يثير الاهتمام والفضول شروط محددة لتشكيل الأغشية الحيوية الناضجة، في نسبة معينة من فراغ الرأس 9:01: وسائل الإعلام، فضلا عن تبادل محدود من الهواء مع الغلاف الجوي 9. ربما يمكن أن متطلبات الظروف البيئية المتخصصة أن ترتبط إلى حقيقة أن م. مرض السل هو الممرض تلزم الإنسان، وبالتالي تكيفت مع البيئات الأنسجة. في هذا المنشور نظهر طرق زراعة M. مرض السلالأغشية الحيوية في زجاجة، وشكل لوحة 12-جيد، وهو مناسب للدراسات البكتريولوجية وكذلك الوراثية. وقد وصفت نحن على بروتوكول لسلالة ضعيفة من م. والسل، ومولودية 2 7000، مع الحذف في مواضع اثنين، panCD وRD1، التي تعتبر بالغة الأهمية للنمو في الجسم الحي من 9 الممرض. ويمكن استخدامها بأمان هذه السلالة في احتواء BSL-2 لفهم البيولوجيا الأساسية للمرض السل الممرض وبالتالي تجنب شرط وجود مرفق BSL-3 باهظة الثمن. ويمكن تمديد هذا الأسلوب، بعد إجراء التعديلات المناسبة في وسائل الإعلام، أن ينمو بيوفيلم من الأنواع الأخرى بالمتفطرات زروع.
وعموما، فإن بروتوكول موحد للاستزراع الأغشية الحيوية بالمتفطرات مساعدة المحققين المهتمين بدراسة الخصائص الأساسية مرونة من متفطرات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن طريقة واضحة وموجزة من الأغشية الحيوية بالمتفطرات متزايد يساعد أيضا في الجرد السريرية والدوائيةestigators لاختبار مدى فعالية دواء المحتملة.
Protocol
Discussion
الدرن (السل)، والناجمة عن الإصابة بمرض السل المتفطرة، لا يزال يشكل خطرا كبيرا على الصحة العامة العالمية. وتشير التقديرات إلى ما يقرب من ثلث سكان العالم مصابون بهذا المرض asymptomatically من قبل الممرض، ونحو 9 ملايين حالة جديدة تظهر في عيادة في كل عام مع أعراض مرض السل الن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تنفيذ العمل بدعم مالي من المعهد الوطني للصحة والجمعية الأمريكية لأمراض الرئة.
Materials
| Equipment and supplies | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| Incubator | VWR | Model # 1923/25 |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 |
| 12-well tissue culture plate | VWR | 62406-165 |
| 50-mL conical tubes | VWR | 89039-660 |
| Rocker | Thermo Scientific | 57019-662 |
| Chromatographic refrigerator | VWR | 55702-520 |
| petri dish | VWR | 25384-342 |
| REAGENT | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD | PX1565-1 |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 |
| L-asparagine | Sigma | A4284-100G |
| citric acid | Sigma | C1857-100G |
| ferric ammonium citrate | Sigma | F5879-100G |
| glycerol | EMD | GX0185-5 |
| NaOH | Sigma | S8045-500G |
| ZnSO4 | Sigma | Z4750-500G |
| D-pantothenic acid | Sigma | P2250-25G |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | Becton Dickinson | 271310 |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 |
| Tween-80 | Fisher | T164-500 |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 |
| 12 well plates | Falcon (BD) | 353043 |
| rifampicin | Sigma | R3501-1G |
| methanol | J.T. Baker | 9070-05 |
| 10mlLsyringe | Becton Dickinson | 301604 |
| 1-200μL pipet tips | VWR | 89079-458 |
| parafilm M | VWR | PM-996 |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | Becton Dickinson | 283810 |
| NaCl | Fisher | BP358-1 |
| KCl | Sigma | P9333-500G |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma | S0876-500G |
References
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
