Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants
Summary
İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir<em> Toxoplasma</em> Onun konakçı hücre gelen egresses. Protokoller, kimyasal parazitler mutagenize için sağlanan indüklenen çıkış defekti olan mutantlar için zenginleştirmek, ve klonlanmış mutantlar fenotip doğrulamak.
Abstract
Yaygın, zorunlu hücre içi protozoon parazit Toxoplasma gondii immün yetmezlikli hastalarda fırsatçı hastalığa yol açan ve konjenital enfeksiyon üzerine doğum kusurlarına neden olur. 1: litik replikasyon siklusu üç aşama ile karakterize edilir. çekirdekli bir konak hücre aktif invazyonu; 2. konak hücre içine replikasyon; 3. konakçı hücreye aktif çıkış. Acil tahliye mekanizma hala tam olarak moleküler düzeyde anlaşılır bir benzersiz, son derece düzenlenir süreci, giderek takdir ediliyor. Çıkış yatan sinyal yollarının yolları farklı yönlerini 1-5 üzerinde etkili farmakolojik ajanların kullanımı ile karakterize edilmiştir. Gibi çıkış birkaç bağımsız tetikler hücre içi Ca 2 sürümü üzerinde birleşmemiz tespit edilmiştir +, konak hücre işgali 6-8 için de kritik olan bir sinyal. Bu anlayış tanımladı yol açan bir aday gen yaklaşımı bilgilendirdification bitki, çıkış 9 içerisinde yer alan, kalsiyum bağımlı protein kinaz (CDPK) gibi. Buna ek olarak,, anlayış çıkış birkaç son buluşların (kimyasal) genetik yaklaşımlar kullanılarak 10-12 yapılmıştır. Toxoplasma artan genetik erişilebilirlik ile farmakolojik bilgi zenginliği birleştirmek için biz son konak hücrenin çıkış 13 bir kusur ile parazit mutantlar için zenginleşmesine izin veren bir ekran kuruldu. Rutin fenotipleri 16 haline 11,14,15 Toxoplasma biyolojisi çalışmada, yıllar boyunca kullanılan N-etil-N-nitrozoüre (TRK) veya etil metansülfonat (EMS) kullanılarak kimyasal mutajenez olmakla birlikte, sadece son yatan mutasyonlar genetik mapping of -18. Ayrıca, ısıya duyarlı mutantlar, gerekli süreçler disseke edilebilir ve altta yatan genleri doğrudan tespit. Bu mutantlar müsamahakar sıcaklığı (35 ° C) altında vahşi türü olarak davranır, ancak p başarısızbir sonucu olarak, söz konusu mutasyonu, kısıtlayıcı sıcaklığında (40 ° C) roliferate. Burada mutantlarının ısıya duyarlı bir çıkış fenotip 13 ile izole etmek için yeni bir fenotipik bir tarama yöntemi göstermektedir. Meydan çıkış ekranlar için yeniden işgali ve parazitlerin konak hücreleri için genel yapışkanlık hızlı karmaşık,-egressed olmayan parazitler, egressed ayrılması için. Daha önce kurulmuş bir çıkış ekran, ekstrasellüler parazitler 11 intrasellüler ayırmak için adımları biyotinilasyon hantal bir serisi dayanmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda zayıf fenotipleri sonuçlanan koşullu mutantlar oluşturmak vermedi. Burada açıklanan yöntem,, parazitleri 19 konak hücre yapışmasını engelleyen glukanıdır bir rakip, dekstran sülfat (DS) de dahil olmak üzere parazitler egressing güçlü bağlılıklarının üstesinden gelir. Ayrıca, ekstraselüler parazitleri özellikle hücre içi parazit bırakır, pirolidin ditiyokarbamatın (PDTC), tarafından öldürüldü20 sağ salim. Bu nedenle, özellikle, indüklenen çıkış hatalarına parazit mutantlar izole etmek için yeni bir fenotipik ekran, genetik güç artık tamamen konak hücre çıkış yatan moleküler mekanizmalar çözülmeye dağıtmış olabilir.
Protocol
Discussion
Açıklanan protokol bir çıkış defekt ile Toxoplasma mutantlar izole etmek için etkili bir yöntem sağlar. Biz çıkış yolu, bir çift işgali fenotip 13 bazıları çeşitli adımlar boyunca başarıyla mutantlar izole. Işgali üzerine potansiyel etkileri diferansiyel antikor boyama 23,24 ile parazit olmayan işgal istila birbirinden ayırmış sözde kırmızı-yeşil testi kullanılarak tespit edilebilir. Hem işgali ve çıkış testleri için bu, parazitler 13,22</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Scientist Kalkınma Hibe 0635480N ve Sağlık araştırmaları hibe AI081220 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. BIC Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı araştırma bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher & Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective |
HBSSc (according to Black et al.11):
- 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
- 100 μl 1M MgCl2 (100 mM end)
- 100 μl 1M CaCl2 (100 mM end)
- 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
- 84 mg NaHCO3 (10 mM end)
References
- Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
- Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii. J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).
- Silverman, J. A. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).
- Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole. Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).
- Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin. Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).
- Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages. Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).
- Hoff, E. F., Carruthers, V. B. Is Toxoplasma egress the first step in invasion. Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).
- Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii. J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).
- Lourido, S. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
- Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation. J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).
- Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress. Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).
- Chandramohanadas, R. Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells. Science. , (2009).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants. Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).
- Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship. Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).
- Striepen, B. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).
- White, M. W. Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant. Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).
- Gubbels, M. J. Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).
- Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment. Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).
- Camps, M., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate. Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).
- Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).
- Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).
- Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion. J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).
- Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).
- Kafsack, B. F. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science. 323 (5913), 530-533 (2009).
- Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).
- Nagamune, K. Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii. Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).
- Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection. J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).
- Persson, E. K. Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).
