Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

Le répandue, intracellulaire obligatoire, parasite protozoaire Toxoplasma gondii qui cause la maladie opportuniste dans les patients immunodéprimés et provoque des malformations congénitales lors de l'infection congénitale. Le cycle de réplication lytique est caractérisée par trois étapes: 1. invasion active d'une cellule hôte nucléé; 2. réplication dans la cellule hôte; 3. évacuation connexion de la cellule hôte. Le mécanisme de sortie est de plus en plus apprécié comme un processus unique et très réglementé, qui est encore mal comprise au niveau moléculaire. Les voies de signalisation qui sous-tendent l'évacuation ont été caractérisées par l'utilisation d'agents pharmacologiques agissant sur ​​les différents aspects des voies ^1-5. En tant que tel, plusieurs déclencheurs indépendants d'évacuation ont été identifiées qui convergent toutes sur la libération de Ca ^{2 +} intracellulaire, un signal qui est également critique pour l'invasion des cellules d'accueil ^6-8. Cette idée a informé une approche gène candidat qui a conduit à l'identificationfication de la plante comme la protéine kinase dépendante du calcium (CDPK) impliqués dans l'évacuation ^9. En outre, quelques avancées récentes dans la compréhension de sortie ont été réalisés en utilisant (chimique) des approches génétiques ^10-12. Pour combiner la richesse de l'information pharmacologique de l'accessibilité croissante génétique de Toxoplasma nous avons récemment créé un écran permettant l'enrichissement de mutants du parasite avec un défaut de sortie cellule hôte ^13. Bien que la mutagenèse chimique utilisant le N-éthyl-N-nitroso-urée (ENU) ou le méthanesulfonate d'éthyle (EMS) a été utilisé pendant des décennies dans l'étude de la biologie Toxoplasma ^11,14,15, n'est que récemment que la cartographie génétique des mutations qui sous-tendent les phénotypes devenu une routine ^{16 -18.} En outre, en générant des mutants sensibles à la température, les processus essentiels peuvent être disséqués et les gènes sous-jacents directement identifié. Ces mutants se comporter comme de type sauvage en vertu de la température permissive (35 ° C), mais ne parviennent pas à proliferate à la température restrictive (40 ° C) en tant que résultat de la mutation en question. Ici, nous illustrer une nouvelle méthode de criblage phénotypique à isoler des mutants avec un phénotype sensible à la température de sortie ^13. Le défi pour les écrans d'évacuation est de séparer est sorti de non-évacué parasites, qui est compliqué par la ré-invasion rapide et collant générale des parasites aux cellules hôtes. Un écran de sortie a été précédemment établi sur la base d'une série d'étapes lourdes biotinylation de séparer intracellulaire de parasites extracellulaires ^11. Cette méthode n'a pas non plus générer des mutants conditionnels résultant de phénotypes faibles. La méthode décrite ici surmonte le fort attachement de egressing parasites en incluant un concurrent glycane, le sulfate de dextrane (DS), qui empêche les parasites de coller à la cellule ¹⁹ hôte. En outre, les parasites extracellulaires sont spécifiquement tué par la pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), ce qui laisse des parasites intracellulairessains et saufs ^20. Par conséquent, avec un nouvel écran phénotypique spécifiquement isoler des mutants de parasites avec les défauts de sortie induite, la puissance de la génétique peuvent désormais être pleinement déployé à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l'évacuation cellule hôte.