Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

De wijdverspreide, obligaat intracellulaire, protozoaire parasiet Toxoplasma gondii veroorzaakt opportunistische ziekte in immuno-gecompromitteerde patiënten en veroorzaakt aangeboren afwijkingen bij congenitale infectie. De lytische replicatiecyclus wordt gekenmerkt door drie stappen: 1. actief invasie van een kern gastheercel, 2. replicatie in de gastheercel; 3. actieve uitgang van de gastheercel. Het mechanisme van de uitgang wordt steeds meer gewaardeerd als een uniek, sterk gereguleerde proces, dat nog steeds slecht begrepen wordt op moleculair niveau. De signaalwegen die ten grondslag liggen uitgang werden gekenmerkt door het gebruik van farmacologische stoffen die op verschillende aspecten van de trajecten ^1-5. Als zodanig verschillende onafhankelijke triggers van uitgang zijn aangewezen, die allemaal samen op het vrijkomen van intracellulaire Ca ^{2 +,} een signaal dat ook is van cruciaal belang voor de gastheercel invasie ^6-8. Dit inzicht op de hoogte van een kandidaat gen aanpak die heeft geleid tot de identificatieMOETEN VOLDOEN van planten, zoals calcium, afhankelijk proteïne kinase (CDPK) betrokken bij uitgang ^9. Daarnaast hebben een aantal recente doorbraken in het begrijpen van uitgang is gemaakt met behulp van (chemische) genetische benaderingen ^10-12. Om de rijkdom van de farmacologische informatie te combineren met de toenemende genetische toegankelijkheid van Toxoplasma we onlangs een scherm mogelijk maakt de verrijking voor de parasiet mutanten met een defect in gastheercel uitgang ^13. Hoewel de chemische mutagenese met behulp van N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of ethyl methaansulfonaat (EMS) is gebruikt voor tientallen jaren in de studie van Toxoplasma biologie ^11,14,15, pas onlangs heeft genetische kaart brengen van mutaties ten grondslag liggen aan de fenotypes routine ^{16 -18.} Bovendien, door het genereren van temperatuurgevoelige mutanten, kan essentiële processen worden ontleed en de onderliggende genen direct geïdentificeerd. Deze mutanten gedragen als wild-type onder de permissieve temperatuur (35 ° C), maar niet proliferate de beperkende temperatuur (40 ° C) als gevolg van de mutatie in kwestie. Hier tonen een nieuw fenotypische screening methode mutanten te isoleren met een temperatuurgevoelige uitgang fenotype ^13. De uitdaging voor uitgaand schermen is af te scheiden uit waren hadden van niet-uit waren hadden parasieten, die wordt bemoeilijkt door een snelle re-invasie en de algemene kleverigheid van de parasieten aan gastheercellen. Een eerder vastgestelde uitgaand scherm was gebaseerd op een omslachtige reeks biotinylatie stappen om intracellulair te scheiden van extracellulaire parasieten ^11. Met deze methode ook niet het genereren van voorwaardelijke mutanten wat resulteert in zwakke fenotypes. De hier beschreven methode overwint de sterke binding van egressing parasieten door er een glycan concurrent dextransulfaat (DS), die voorkomt parasieten kleven aan de gastheercel ^19. Bovendien zijn extracellulaire parasieten specifiek gedood door pyrrolidine dithiocarbamaat (PDTC), die intracellulaire parasieten verlaatongedeerd ^20. Daarom, met een nieuwe fenotypische scherm om specifiek parasiet mutanten te isoleren met defecten in geïnduceerde uitgang, kan de kracht van de genetica nu worden ingezet om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen gastheercel uitgang te ontrafelen.