I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

1. Fare sperm dondurulması Kriyoprezerve her satırı için, başlamadan önce aşağıdaki hazırlamak. 1 kiti CPA 240 l 4-iyi bir yemek, iyi Aşağıdaki gibi 15 sperm dondurulması payet Şırıngaya yakın pamuk fişi ile 1 ml şırınga 0,25 ml payet bağlayın. Her saman, sonra IVF orta 8 cm (yaklaşık 160 ul), 1 cm hava yükleyin. Payet korunacak hattın adı ile etiketleyin. LN 2 derin köpük kutusunda 15 cm olmalıdır. Kapağını kapatın. Kriyoprezerve her satırı 2 erkek fareler Euthanize. Fareler, 10 ve 60 haftalık arasında olmalıdır. Her fare vas deferens ile birlikte iki kaudal epididymides çıkarın. Önceden hazırlanmış 4-iyi bir çanak (adım 1.1) EBM içeren epididymides yerleştirin. Her epididim 5-7 uzunlamasına keser ve nazik olunSperm dışarı itmek için her vas deferens sıkın. 3-5 dakika oda sıcaklığında CPA ve epididim karışımı elle hafifçe sallayın. Bu sperm yüzmek için izin verecektir. Önceden hazırlanmış saman kullanarak, sperm süspansiyonu 5 mm (yaklaşık 10 ul) aspirat ve ardından havanın 1 cm. Toplam 15 payet kadar bu işlemi tekrarlayın. Yük ve en iyi sperm hayatta kalmak için 10 dakika içinde payet mühür. Saman her iki tarafında dikkatli mühür ısıtın. Ilk sperm sütun donma spreyi payet yerleştirin. 1 ml pipet kolu uzatmak için spreyi kitinin bir parçası olarak sağlanan takın. LN 2 teneke kutu kapağı delikten köpük kutusuna yerleştirin. 10 dakika için LN 2 dikey float spreyi izin verin. LN2 spreyi bırakın. Sperm Kriyoprezerve ve uzun vadeli LN 2 depolama taşınmış olabilir. Spreyi kullanılmamalıdırbir sonraki satıra kadar oda sıcaklığına kadar ısıtılır. 2. Fare süperovulasyon Genel olarak, genç dişi farelerde sperm vericisi olarak aynı arka plan kullanın. Fare ~ 12 g (yaş 3-4 hafta) olmalıdır. Hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG) 5-10 IU ile bir intraperitoneal gerçekleştirin. 46-48 saat bekleyin. 5-10 IU insan koryonik gonadotropin (hCG) ile bir intraperitoneal gerçekleştirin. HCG enjeksiyonu sonrasında aşağıda açıklandığı gibi Hasat oosit 14-16 saat. 3. Fare sperm ve IVF IVF önce çözülmüş olması için her saman için, en az bir saat için 37 ° C CO 2 inkübatör aşağıdaki hazırlamak ve dengelenmesi. Sperm inkübasyon çanak: bir 35 mm Petri kabında 90 ul bir damla yağ ile kaplı sperm tedavi orta (STM). Kesme çanak: Yumurta toplama için en fazla 10 snuperovulated kadın, 3 ml IVF orta ile 35 mm Petri kabında. IVF: IVF için 5 süperovulasyon kadın, IVF orta 500 ul (.. 10 süperovulasyon kadın kullanıyorsanız, örneğin, 2 kuyu gerekecektir) ile 4 sıra çanak iyi bir her grup için Kullanılan 4-iyi IVF çanak her iyi yıkamak için 3 ml potasyum simpleks optimize orta (KSOM) ile bulaşık bir 35 mm Petri kabı: Kültür çanak: 50 IVF yemeğin her kuyudan petrol embriyo kültürü ile kaplı KSOM orta ul damla bir 35 mm Petri kabında. LN 2 ile saman ve 2-3 dakika 37 ° C su banyosunda yer çıkarın. Su banyosu saman çıkarın ve fazla suyu kaldırmak için silin. İlk kesilen pamuk fiş en yakın ilk hava sütunu yakın olun. Hala bir hava sütunu sperm sütun önce görünür olacaktır IVF orta saman kesin. Sonra saman s ucuecond hava sütun, sperm sütun kesme önlemek için dikkatli olmak. 45 açıyla Kes – Bu sperm aspire çok daha kolay hale getirecek. 200 ul pipet ile saman distal ucundan sperm süspansiyonu aspire. STM damla merkezi sperm süspansiyonu yerleştirin ve 45-60 dakika boyunca 37 ° C% 5 CO 2 inkübatör inkübe çanak. Sperm inkübasyon sırasında, kesme çanak içine süperovulasyon kadın siyon hatası teşrih. Cumulus-oosit kompleksleri (COC) bırakmadan, her yumurtalık gözyaşı 30 g iğne veya forseps kullanın. IVF orta kirli medya, ekstra yıkama adımlar için yapar gibi yağ ve kan kaçının. Bir kez tüm siyon hatası yıkılarak, 5 kadın her IVF kuyuları Kombine oral kontraseptif aktarın. Süperovulasyon tarafından üretilen kombine oral kontraseptif sayısı çok bağımlı süzün. STM damla çevreden sperm 10-15 ul toplayın ve bir IVF döller de yaklaşık 14-16 saat hCG injection. Her bir kuyunun kullanılan gübreleme tekrarlayın. Final sperm konsantrasyonu yaklaşık 1 milyon / ml olacaktır. 4-6 saat 37 ° C% 5 CO 2 inkübatör Coculture sperm ve oosit. Embriyoların gelişimi için 37 ° C% 5 CO 2 inkübatör KSOM damla en az 2 kez ve kültür KSOM ile yıkayın. IVF oranı gece kültürden sonra kullanılan toplam oositlerin iki hücre sahne olan embriyolar gibi hesaplanmıştır. 4. Temsilcisi Sonuçlar 5 Charles Nehri fare kendilenmiş suşlarının sperm donduruldu. Koruma oranları taze sperm değerlendirmesi değerleri ile dondurulmuş sperm değerlendirme değerleri bölünmesiyle hesaplanır. Sperm Koruma oranları sırasıyla% 60.2,% 81.3,% 78.6,% 66.5,% 61.0 'C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl FVB / NCrl, DBA/2NCrl ve BALB / cAnNCrl. Hızlı progresif motilite için koruma oranları% 47.3,% 69.4,% 57.0,% 52.8,% 54.1 C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl ve sırasıyla BALB / cAnNCrl (Şekil 1). Dondurulmuş çözülmüş sperm ile tüp bebek oranı% 55.7,% 26,4,% 87.3,% 87.8 ve C57BL/6NCrl yılında sırasıyla 26.2%, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl DBA/2NCrl ve BALB / cAnNCrl (Şekil 2) . 1.5 yıllık bir dönemde, 49 GM fare hatları sperm dondurulması tarafından arşivlenir. Bu satırlar, daha sonra başarılı IVF (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 ve 129Sv), 4 kadın suşları (Şekil 3) (canlı doğan yavrular tarafından tanımlandığı gibi) ele geçirilmiştir. Şekil 1: Fareler ve Sperm Hareketliliği Hızlı Aşamalı Motilite Koruma Oranları Farelerde Dondurulmuş çözülmüş Sperm Şekil 2. In Vitro Fertilizasyon 3713fig3.jpg "/> Şekil 3. GM Farelerde Dondurulmuş çözülmüş Sperm ile in vitro fertilizasyon