Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit

1. Muis sperma cryopreservatie Voor elke regel te zijn gecryoconserveerd, bereiden de volgende voordat u begint. Een goed van een 4-goed schotel met 240 l van de kit CPA 15 sperma cryopreservatie rietjes als volgt Sluit de 0,25 ml rietjes tot het 1 ml spuiten met de katoenen stekker die het dichtst bij de spuit. In elke stro, load 8 cm (ongeveer 160 pl) van IVF medium, dan 1 cm van de lucht. Label de rietjes met de naam van de lijn te behouden. LN 2 moet 15 cm diep in het schuim doos. Sluit het deksel. Euthanaseren twee mannelijke muizen van elke regel te worden gecryopreserveerd. Muizen moet tussen 10 en 60 weken oud. Verwijder de twee caudale epididymides samen met de zaadleider van elke muis. Plaats de epididymides in de vooraf bereide CPA-bevattende goed van een 4-goed schotel (stap 1.1). Maak 5-7 sneetjes die in elke bijbal en voorzichtigknijp elke zaadleider om sperma te duwen. Schud de CPA en de bijbal mengsel met de hand zachtjes bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten. Dit zal toelaten om te zwemmen zaadcellen uit. Met behulp van de vooraf bereide stro, aspiratie 5 mm (ongeveer 10 ul) van sperma suspensie en vervolgens 1 cm van de lucht. Herhaal dit proces met maximaal een totaal van 15 rietjes. Laden en seal rietjes binnen 10 minuten voor de beste zaadcellen overleven. Verhit voorzichtig afdichting aan beide zijden van het stro. Leg de rietjes in de bevriezing bus met het sperma kolom eerste. Bevestig de 1 ml pipet geleverd als onderdeel van de kit om de bus aan het handvat uit te breiden. Plaats de container in LN 2 in het schuim doos door het gat in het deksel. Laat de bus verticaal zweven in de LN 2 voor 10 minuten. Dompel de bus in de LN2. Het sperma is nu gecryopreserveerd en kan worden verplaatst naar de lange termijn LN 2-opslag. De bus mag niet worden gebruikt voorde volgende regel totdat het wordt opgewarmd tot kamertemperatuur. 2. Muis superovulatie Algemeen, een gebruik jonge vrouwelijke muizen van dezelfde achtergrond als het sperma donoren. Muizen moet worden ~ 12 g (3-4 weken oud). Voer een intraperitoneale injectie met 5-10 IE drachtige merrie serum gonadotropin (PMSG). Wacht 46 tot 48 uur. Voer een intraperitoneale injectie met 5-10 IE humaan choriongonadotrofine (hCG). Oogst eicellen 14-16 uur na de hCG-inspuiting zoals hieronder beschreven. 3. Muis sperma herstel en IVF Voor IVF, voor elke stro te worden ontdooid, de voorbereiding van de volgende en voor minstens een uur equilibreren in een 37 ° C CO 2 incubator. Sperma incubatie gerecht: een 35 mm petrischaal, met een 90 ul druppel sperma behandeling medium (STM) bedekt met olie. Cutting gerecht: Voor eicel collectie van maximaal 10 superovulated vrouwtjes, een 35 mm petrischaal met 3 ml van IVF medium. IVF goed: Voor elke groep van vijf gesuperovuleerde vrouwen voor IVF, een putje van een 4 goed schotel met 500 pi van IVF medium (indien u gebruik maakt van 10 gesuperovuleerde vrouwen, bijvoorbeeld, moet u twee putten…) Wassen gerecht: een 35 mm petrischaal met 3 ml van kalium-simplex geoptimaliseerd medium (KSOM) voor het wassen elk putje van de 4-goed gebruikt IVF schotel Cultuur gerecht: een 35 mm petrischaal met 50 ul druppels KSOM medium bedekt is met olie voor embryo cultuur uit elk putje van de IVF-schotel. Verwijder een stro van LN 2 en plaats in een 37 ° C waterbad gedurende 2-3 minuten. Verwijder het stro van het waterbad en veeg om het overtollige water te verwijderen. Maak de eerste snede dicht bij de eerste kolom lucht het dichtst bij de katoen stekker. Snijd de stro in de IVF-medium zal er nog steeds een luchtkolom zien voordat het sperma kolom. Knip dan de uiteinde van het rietje in de sWEEDE luchtkolom, zorg ervoor om te voorkomen dat het snijden van de zaadcellen kolom. Snij bij een 45 hoek – dit maakt het veel gemakkelijker om het sperma zuigen. Zuig het sperma schorsing van het distale uiteinde van het rietje met een 200 ul pipet. Plaats het sperma suspensie in het centrum van de STM laten vallen en incubeer de schotel voor 45-60 minuten in een 37 ° C 5% CO 2 incubator. Tijdens het sperma incubatie, ontleden de eileiders van de gesuperovuleerde vrouwen in de snij-schotel. Gebruik een 30 g naald of pincet aan elke eileider scheuren, het loslaten van de cumulus-complexen eicel (COC's). Vermijd vet en bloed in de IVF-medium als vuile media zorgt voor een extra wasstappen. Zodra alle eileiders zijn gescheurd, overdracht van de combinatie-OAC's van vijf vrouwtjes aan elke IVF putten. Het aantal van COC's geproduceerd door superovulatie is zeer afhankelijk van soort. Verzamel 10 tot 15 ul van sperma uit de periferie van de STM te laten vallen en bemesten een IVF ook ongeveer 14-16 uur na de hCG injectie. Herhaal dit voor elke bemesting goed gebruikt. Uiteindelijke spermaconcentratie zal ongeveer 1 miljoen / ml. Coculture sperma en eicellen gedurende 4-6 uur in een 37 ° C 5% CO 2 incubator. Was de embryo's met KSOM een minimum van 2 keer en cultuur in KSOM druppels voor ontwikkeling in een 37 ° C 5% CO 2 incubator. IVF werd berekend als twee cellig stadium embryo's uit eicellen van het totaal gebruikte na een nacht cultuur. 4. Representatieve resultaten Sperma van 5 Charles River muis inteeltstammen was bevroren. Bescherming van ratio's zijn berekend door het ingevroren sperma beoordeling waarden door vers sperma beoordeling waarden. Bescherming verhoudingen van beweeglijkheid van de zaadcellen was 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% voor C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, en BALB / cAnNCrl, respectievelijk. Bescherming van ratio's voor een snelle progressieve motiliteit was 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, en BALB / cAnNCrl, respectievelijk (afb. 1). De IVF-tarieven met ingevroren-ontdooide zaadcellen waren 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% en 26,2% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, en BALB / cAnNCrl, respectievelijk (Fig 2) . Over een periode van 1,5 jaar werden 49 GM muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie. Deze lijnen werden later met succes teruggevonden (zoals gedefinieerd door levende jongen geboren) door IVF in 4 vrouwelijke stammen (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 en 129Sv) (afb. 3). Figuur 1. De bescherming Ratio van de beweeglijkheid van de zaadcellen en de snelle progressieve motiliteit in Muizen Figuur 2. In Vitro Fertilisatie met Frozen-ontdooid sperma in Muizen 3713fig3.jpg "/> Figuur 3. In vitro fertilisatie met Frozen-ontdooid sperma in GM Muizen