הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit
Summary
כאן אנו מדגימים את החדש שפותח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. שני תאים בשלב התפתחות העובר עם זרע קפוא מופשר השתפר באופן עקבי 5 זנים עכבר עם השימוש בערכה זו. במשך 1.5 שנים, 49 קווי עכבר מהונדסים גנטית היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכה ולאחר מכן התאושש בהצלחה על ידי הפריה חוץ גופית.
Abstract
אלפי החדשה שונה גנטית (GM) זנים של עכברים שנוצרו מאז כניסתו של טכנולוגיות transgenesis ו בנוקאאוט. רבים מהם בעלי ערך קיים רק בבעלי חיים, בלי תוכנית גיבוי למקרה חירום. Cryopreservation של עוברים יכולים לספק גיבוי זה, אבל הוא יקר, יכול להיות תהליך ארוך, ובדרך כלל דורש מספר רב של בעלי חיים להצלחה. מאז גילויו כי זרע העכבר ניתן cryopreserved בהצלחה עם סוכן cryoprotective בסיסי (רו"ח) המורכב raffinose 18% ו 3% חלב רזה, cryopreservation הזרע הפך הליך מקובל וחסכוני עבור אחסון, הפצה ההתאוששות של אלו זנים בעלי ערך .
כאן אנו מדגימים פיתח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. הזרע של חמישה זנים נפוץ בשימוש של עכברים טבועה הוקפאו באמצעות ערכת התאושש לאחר מכן. הגנה יחס גבוה של תנועתיות הזרע (>60%) ו תנועתיות פרוגרסיבית מהירה (> 45%) לעומת לשלוט (בסיסי רו"ח) נראו עבור זרע קפוא עם ערכת זה 5 זנים עכבר מולדת. בשלב שני התא עובר התפתחות לאחר הפריה חוץ גופית עם הזרע התאוששה היה שיפור עקבי בכל 5 זנים העכבר נבדק. במשך 1.5 שנים, 49 קווי GM עכבר היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכת והתאושש מאוחר יותר על ידי הפריה חוץ גופית.
Protocol
Discussion
מאז שנת 1990, הקפאת הזרע בסיסי באמצעות פרוטוקול raffinose 18% ו 3% חלב רזה הוכח אמין זנים רבים של עכברים מספר רב של קווי העכבר כבר cryopreserved 1,2,3,4,5,6,7. הגורמים העיקריים לנזק לתאי זרע במהלך הקפאת תהליך ההפשרה קושרו עם היווצרות קרח 8,9 ו – 10 מינים חמצן תגובתי. תוספת של נוגדי רדיקלים חופשיים, כגון חומצות אמינו, וסוכני צמצום, כגון monothioglycerol, במדיום הקפאת נחקר והוכח באופן משמעותי להגדיל את שיעור הפריה חוץ גופית עם זרע קפוא מופשר של זנים טהורים כולל C57BL / 6 11,6.
בפרוטוקול הנוכחי, פיתחנו חדש אני cryo • ערכת cryopreservation זרע העכבר על ידי אופטימיזציה של רו"ח בסיסית עם נוגדי חמצון זמינים מסחרית חוסמי קרח על ידי שינוי הקפאת זרע הליך ההפריה החוץ גופית. הגנה יחסי של תנועתיות הזרע(> 60%) ו תנועתיות פרוגרסיבית מהירה (> 45%) נצפו במשך הזרע של חמישה זנים טהורים עכבר קפוא עם • אני cryo הערכה. 2 תאים העובר בשלב התפתחות שיעור עם זרע קפוא מופשר ב 5 זנים טהורים העכבר היה שיפור ניכר בהשוואה לזו עם בסיסי רו"ח 11,6.
במהלך השימוש בערכה, המשתמש יוצר ההשעיה זרע מרוכז על ידי הקפאת זרע של 2 גברים על כל שורה. על ידי הקפאה רק 15 קשיות התהליך הוא מהיר, קל תופסת פחות מקום אחסון לאחסון קצר או לטווח ארוך. רוב הפעמים, קווי העכבר ניתן לשחזר על ידי הפשרת רק 1 או 2 קשיות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר המוצג כאן נתמכה על ידי צ'ארלס ריבר. המחברים מודים ביותר של מודלים מהונדסים גנטית וקבוצת שירותים וצוות אמבריולוגיה לטיפול בבעלי חיים הזרקת ההורמון.
Materials
| Materials | Supplier | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| CPA | Charles River | Provided with kit | |
| STM | Charles River | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nunc | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| hCG | Intervet | ||
| PMSG | EMDChemicals | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD | 305106 | |
| Scissors | Roboz | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
