Simple y robusto En vivo Y In vitro Enfoque para el estudio de ensamblaje del virus
Summary
Una manera sencilla, eficiente y robusta para sincronizar la entrega de múltiples componentes virales a las células vegetales mediante<em> Agrobacterium</em> Mediada por la expresión transitoria se describe. Este enfoque es susceptible para el estudio de la replicación, encapsidación seguido por<em> In vitro</em> Montaje de los componentes no virales en el genoma agotado ópticas fantasmas virales adecuados para aplicaciones biomédicas.
Abstract
En los virus con ARN de sentido positivo genomas patógenos para los seres humanos, animales y plantas, la progenie de encapsidación en viriones maduros y estables es una fase de cardenal durante el establecimiento de la infección en un equipo dado. En consecuencia, el estudio de encapsidación descifra la información relativa a los conocimientos del mecanismo de regulación de ensamblaje del virus para formar viriones infecciosos. Dicha información es de vital importancia en la formulación de nuevos métodos de frenar la propagación del virus y control de la enfermedad. Encapsidación del virus puede ser estudiado in vivo e in vitro. Encapsidación del genoma en vivo es un proceso altamente regulado selectiva que implica interacciones macromoleculares y compartimentación subcelular. Por lo tanto, el estudio que lleva a diseccionar los acontecimientos que abarcan encapsidación del virus in vivo proporcionará los conocimientos básicos para comprender cómo los virus proliferan y se ensamblan. Recientemente, en la encapsidación in vitro ha sido explotada para la investigación en el área de la investigación biomédica imaging y aplicaciones terapéuticas. Virus no envueltos de plantas destacan muy por delante en la aventura de en la encapsidación in vitro de la materia con carga negativa externa. Virus de mosaico Brome (BMV), un no envueltos multicomponente patógeno virus ARN a las plantas, ha sido utilizado como un sistema modelo para estudiar embalaje genoma in vivo e in vitro. Para los ensayos de encapsidación en plantas de Nicotiana benthamiana, mediada por Agrobacterium expresión transitoria, se refieren como agroinfiltración, es una técnica eficaz y sólido para la entrega sincronizada y la expresión de varios componentes para la misma célula. En este enfoque, una suspensión de Agrobacterium tumefaciens que llevan las células binarias de vectores plásmidos portadores de ADNc de ARNm desiredviral se infiltra en el espacio intercelular de la hoja withina usando nada más sofisticado que el de una jeringa desechable de 1 ml (sin aguja). Este proceso resulta en la transferencia de inserción de DNA en células vegetales; el T-DNAinserto se mantiene transitoriamente en el núcleo y luego se transcribe por el huésped polimerasa II, que conduce a la expresión transitoria. La transcripción del ARNm resultante (nivelado y poliadenilado) luego se exporta al citoplasma para su traducción. Después de aproximadamente 24 a 48 horas de incubación, las secciones de hojas infiltradas pueden ser degustados por microscopyor análisis bioquímicos. Agroinfiltration permite una gran cantidad (cientos o miles) de las células para ser transfectadas de forma simultánea. Para en la encapsidación in vitro, los viriones purificados de BMV se disocian en proteína de la cápside por diálisis frente a tampón de cloruro de disociación que contiene calcio seguido de la eliminación de ARN y viriones no-disociados por centrifugación. Genoma subunidades de proteína de cápside empobrecido se vuelve a montar con los componentes deseados del genoma viral o no viral de componentes tales como indocianina.
Protocol
Discussion
Enfoque agroinfiltration que aquí se presenta ampliamente puede ser aplicable a una amplia gama de virus de plantas. Una característica distintiva de este enfoque se sincroniza la entrega de múltiples agroconstruct a la celda-un mismo inconveniente importante comúnmente asociada con la inoculación utiliza rutinariamente mecánica de virus de plantas. In vivo e in vitro en los estudios de montaje utilizando virus del mosaico del bromo como un modelo puede llevar a cabo eficientemente por siguientes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a varios miembros del laboratorio por sus valiosas sugerencias en el desarrollo de agroinfiltración y en ensayos in vitro de montaje. Este trabajo fue financiado por una beca de la Universidad de California. Este estudio fue apoyado en parte por una beca de la National Science Foundation (CBET-1144237).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
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