Simples e robusto In vivo E In vitro Abordagem para o Estudo Assembléia Virus

Em vírus com sentido positivo patogênico genomas RNA de seres humanos, animais e plantas, de encapsidação progênie em viriões maduros e estáveis ​​é uma fase cardeal durante o estabelecimento da infecção em um determinado host. Consequentemente, o estudo de encapsidação decifra as informações sobre o know-how do mecanismo de regulação montagem do vírus para formar virions infecciosos. Essa informação é vital na formulação de novos métodos de contenção propagação do vírus e controle da doença. Encapsidação vírus pode ser estudada in vivo e in vitro. Encapsidação Genoma in vivo é um processo altamente regulado seletiva envolvendo interações macromoleculares e compartimentalização subcelular. Portanto, estudar levando a dissecar eventos abrangendo encapsidação vírus in vivo seria fornecer conhecimentos básicos para compreender como os vírus se proliferam e montar. Recentemente, em encapsidação vitro tem sido explorada para a pesquisa na área de biomédica imaging e aplicações terapêuticas. Vírus não-envelopados plantas estão muito à frente no empreendimento de encapsidação em vitro da matéria carregada negativamente estrangeira. Brome vírus do mosaico (BMV), um não encapsulado multicomponente patogenicidade do vírus de RNA para plantas, tem sido utilizado como um sistema modelo para estudar embalagem genoma in vivo e in vitro. Para os ensaios de encapsidação em plantas de Nicotiana benthamiana, mediada por Agrobacterium de expressão transiente, se referem como agroinfiltration, é uma técnica eficiente e fiável para a entrega sincronizado e expressão de componentes múltiplos para a mesma célula. Nesta abordagem, uma suspensão de células de Agrobacterium tumefaciens que transportam binários vectores plasmídicos transportando cDNAs de mRNAs desiredviral é infiltrado no espaço intercelular folha withina usando nada mais sofisticado que uma seringa de 1 ml descartável (sem agulha). Este processo resulta na transferência de inserção de ADN em células vegetais; o T-DNAinserto permanece transientemente no núcleo e, em seguida, é transcrito pelo hospedeiro polimerase II, que conduz à expressão transiente. A transcrição do mRNA resultante (nivelado e poliadenilado) é então exportado para o citoplasma para a tradução. Após aproximadamente 24 a 48 horas de incubação, as secções de folhas infiltradas pode ser amostrada para microscopyor análises bioquímicas. Agroinfiltration permite um grande número (centenas a milhares) de células a serem transfectadas simultaneamente. Para na encapsidação vitro, partículas virais purificadas de BMV são dissociados em proteína da cápside por diálise contra a dissociação de cloreto de cálcio tampão contendo seguido por remoção de RNA e un-dissociados viriões por centrifugação. Genoma empobrecido subunidades da proteína da cápside são reagrupados com desejados componentes do genoma viral ou não virais, tais como componentes indocianina corante.