פשוט וחזק In vivo ו במבחנה גישה ללימוד הרכבה וירוס
Summary
דרך פשוטה, יעילה וחזקה כדי לסנכרן את המסירה של מרכיבים נגיפיים מרובים בתאי צמח באמצעות<em> Agrobacterium</em> בתיווך ביטוי חולף מתואר. גישה זו ניתנת ללימוד שכפול, encapsidation ואחריו<em> במבחנה</em> והרכבה מחדש של רכיבים שאינם נגיפיים לתוך הגנום מדולדל רוחות ויראלי אופטיים מתאימים עבור יישומים ביו.
Abstract
בשנת וירוסים עם פתוגניים חיובי במובן הגנום RNA לבני אדם, בעלי חיים וצמחים, encapsidation צאצאים לתוך virions בוגרת ויציבה היא השלב הקרדינל במהלך הקמת זיהום המארח נתון. כתוצאה מכך, המחקר של encapsidation מפענח מידע על הידע של מנגנון ויסות הרכבה וירוס כדי ליצור virions זיהומיות. מידע זה חיוני בגיבוש שיטות חדשניות של בלימת התפשטות וירוס לבקרת מחלות. Encapsidation וירוס ניתן ללמוד in vivo ו במבחנה. Encapsidation הגנום in vivo היא תהליך סלקטיבי פיקוח הדוק מעורבים באינטראקציות macromolecular ו המידור subcellular. לכן, ללמוד המוביל לנתח אירועים המקיף encapsidation וירוסים in vivo יספק ידע בסיסי כדי להבין כיצד וירוסים להתרבות ולהרכיב. לאחרונה encapsidation חוץ גופית נוצל למחקר בתחום של ביו IMAגינג ויישומים טיפוליים. שאינם עטופים וירוסים צמחיים לעמוד רחוק במיזם של ב encapsidation חוץ גופית של חומר זר טעון שלילית. וירוס Brome פסיפס (BMV), שאינם עטופים multicomponent פתוגניים RNA וירוס לצמחים, שימש כמערכת מודל לחקר הגנום אריזה in vivo ו במבחנה. מבחני encapsidation בצמחים ניקוטיאנה benthamiana, Agrobacterium בתיווך ביטוי חולף, מכנים agroinfiltration, היא טכניקה יעילה וחזקה למסירה מסונכרן וביטוי של רכיבים מרובים באותו התא. בגישה זו, ההשעיה של תאים Agrobacterium tumefaciens הנושאים פלסמיד וקטורים בינאריים הנושאים cDNAs של mRNAs desiredviral הוא שחדר עלה אינטר שטח withina באמצעות לא מתוחכמת יותר מזרק חד פעמי 1 מ"ל (בלי מחט). תהליך זה גורם להעברת להוסיף לתוך ה-DNA בתאי צמח, T-DNAהכנס נותר זמני בגרעין והוא עיבד מכן על ידי פולימראז II המארח, מה שמוביל ביטוי חולף. תעתיק mRNA וכתוצאה מכך (כתרים ו polyadenylated) מיוצא ואז הציטופלסמה לתרגום. לאחר כ 24 עד 48 שעות של דגירה, קטעי עלים ההסתננות ניתן שנדגמו עבור ניתוחים ביוכימיים microscopyor. Agroinfiltration מאפשר מספר גדול (מאות עד אלפים) של תאים transfected להיות בעת ובעונה אחת. שכן encapsidation חוץ גופית, virions מטוהרים של BMV הם ניתק את החלבון capsid ידי dialyzing נגד ניתוק המכילה סידן כלוריד חיץ ואחריו הסרת RNA ובלתי הסתייגותם virions על ידי צנטריפוגה. הגנום יחידות משנה מרוקנים חלבון קפסיד הם מחדש אז עם הרכיבים הרצויים הגנום הנגיפי או שאינם נגיפיים רכיבים כגון indocyanine צבע.
Protocol
Discussion
הגישה המוצגת כאן יכול Agroinfiltration נרחב לחול על מגוון רחב של וירוסים צמחיים. תכונה סימן ההיכר של גישה זו מסונכרן מסירת agroconstruct מרובות תאים באותו החיסרון העיקרי נפוץ הקשורים חיסון מכני בשימוש שגרתי של וירוסים צמחיים. In vivo ו במבחנה הרכבה באמצעות וירוס Brome פסיפס כמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות כמה מחברי המעבדה לקבלת הצעות ערך שלהם בפיתוח agroinfiltration וב מבחני חוץ גופית הרכבה. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם אוניברסיטת קליפורניה. מחקר זה נתמך חלקי על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (CBET-1144237).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
