Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

1. Подготовка низкого загрязнения фоне Взвесить 2 г поли (гидроксиэтилметакрилат) (ПХЕМА) (Sigma – культура клеток проверено) в 50 мл центрифужные пробирки. Растворить в 50 мл 95% (объем / объем) этанола в воде. Это обычно занимает 24 часов обработки ультразвуком. Dip-слой эпоксидной функциональной предметное стекло (Genetix) с решением ПХЕМА. Эпоксидные группы быстро образуют ковалентные связи с покрытием ПХЕМА. Dip-покрытия достигается путем проведения стекло с помощью пинцета и погружения слайда в раствор. Обычно 5 мм слайд остается без покрытия, которое полезно для ориентирования слайдов, а также может выступать в качестве положительного контроля, придерживаясь поверхности. Слайд затем удаляется из раствора ПХЕМА в течение 1 с, переворачивают и оставляют сушиться в ближайшем горизонтальном положении в течение 10 мин перед размещением в держателе слайдов. ПХЕМА покрытием слайды затем уехал в атмосферных условиях в течение 1 недели, чтобы позволить полное испарение тОн растворителя. 2. Приготовление раствора мономера Взвесьте 120 мг фотоинициатора 2,2-диметокси-2-фенил ацетофенон и добавить в 3 мл диметилформамида (DMF), чтобы сделать 4% (вес / объем) фотоинициатор решение. Это лучше всего сделать свежий перед каждым тиражом, так что масса и объем раствора, приготовленного может быть изменена в соответствии сколько фотоинициатора решения не требуется. Раствор стабилен в течение месяца. Мономер решения принимаются путем добавления 1 часть фотоинициатора решение 3 части аккуратно мономера. Это достигается с помощью пипетки 5 мкл раствора фотоинициатора и 15 мкл мономера в 384-луночные пластины источник. Общий объем 20 мкл идеально подходит для пятен. Рост объемов требует дополнительных промокательной до равномерного пятна могут быть произведены. Меньшие объемы могут привести к неполной загрузке PIN-код. Этот метод в настоящее время ограничивается использованием акрилатных / метакрилата мономеры, которые растворимы в ДМФА В. И.РУТП из них является только комбинации, которые были изучены; акриламида и других растворителей, скорее всего поддается процессу печати. Для достижения концентрации мономера предложил (75% м / м) жидких мономеров также необходимы, хотя более низкие концентрации мономера могут быть использованы для твердых мономеров (снижение концентрации мономера, кажется, не отрицательно повлиять на поверхности химии Полученный полимер однако это Вероятно, что молекулярный вес и переход температуры стекла изменяется). Легколетучих мономеров также трудно использовать из-за быстрого испарения мономера до УФ-отверждения шаг, когда полимеризации. В зависимости от количества мономера решения перспективе может занять до 6 часов, а к концу выполнения летучих мономеров испарились из источника пластины. Использование летучих мономеров может быть достигнуто путем охлаждения стадии печати и с использованием коротких тиражей только. За исключением нескольких высоко гидрофильных мономеровтакие как поли (этиленгликоль) акрилат, роспуск результирующая пятна полимеров в водных буферах не наблюдается, таким образом, использование сшивающих мономеров не требуется, хотя не исключено. 3. Полимерные микрочипов образование Типичный порядок формирования полимера микрочипов схематически изображен на рисунке 1. Microarray формирования достигается с помощью контакта робота (Biodot) с помощью этапе XYZ (рис. 2). Шлицевая контакты диаметром 220 мкм используются (Arrayit 96B). Все выводы должны быть очищены с помощью ультразвука в дихлорметане за 10 минут до тиража и также контактный держатель также должны быть очищены. Пальцы загружаются в держатель, блоттинга и массив слайды загружены и тогда весь камера заполнена аргоном для снижения уровня кислорода до уровня ниже 2000 частей на миллион, что является достаточно низким, чтобы избежать гашения полимеризации радикалов кислорода. Влажность maintaineD в пределах 30-40%. В том числе влажности позволяет ПХЕМА к набуханию позволяет образовавшийся полимер проникают ПХЕМА слоя и стать физически захваченные на поверхности 2. Тираж которого начинается. Каждый прогон состоит из: Загрузка образца от источника пластины. Пальцы опускают в растворах при скорости 25 мм / с, состоявшейся в растворе в течение 2,5 с, а затем отозван со скоростью 25 мм / с (рис. 2). Пальцы должны быть уничтожены перед печатью, чтобы удалить раствор мономера с внешней стороны пальца. Впоследствии мономера доставка происходит от гофрированный часть булавку, чтобы добиться последовательного формирования месте. Промокательной последовательности, используемой состоит из 33 контактов с чистой предметное стекло. За первые четыре позиции количество контактов, составляет 10, 5, 4 и 3 соответственно. В следующих четырех положениях 2 контакты сделаны и в последние 3 позиции 1 контакт. Общее время контакта для каждого контакта составляет 10 мс и подходе и выходе скорость составляет 175мм / с. К этому моменту пятна, образованные должны иметь последовательную форму и геометрию. Отказ в этот момент указывает нечистых контактов или пыли, загрязняющих веществ в мономер решений. Мономера решения затем печатается на ПХЕМА покрытием предметные стекла (рис. 2). Один контакт сделан на месте в контактный движения 175 мм / с и времени контакта 10 мс, который в зависимости от вязкости и поверхностной энергии раствор мономера дает средний диаметр пятна 400 мкм. Обычно 3 повторных массивы напечатать на каждом стекле и в общей сложности 10 слайдов напечатаны на одном счете. Это соответствует 30 точек за один цикл. Пальцы промывают в DMF. 2,5 л свежего DMF предназначен для всего цикла стирки. Пальцы промывают в проточной ванне с агитация. Одновременно с мойки, свежеотпечатанные слайды облучении УФ короткие волны (365 нм) источников с плотностью 30 мВ / см 2 в течение периода стирка, которая длится 30 секунд. осле все решения мономера печатаются массивы облучении УФ (365 нм) для дополнительных 10 мин. Свежеотпечатанные массивы хранятся при низком давлении (<50 мТорр) в течение 1 недели, чтобы удалить неполимеризованных мономера и растворителя. 4. Высокая пропускная характеристика поверхности (ВТСП) Общая схема ВТСП методами показано на рисунке 3. Центральное место в автоматизированных, высокая пропускная способность подхода является выравнивание полимера микрочипов с характеристикой аппарата. Во всех случаях это достигается с помощью камеры, которая дает вид сверху массива. Изначально массив вращается в увязке с движением XY сцены. Углу места массива, то находится и назначенных конкретным координатам. Положение каждой точки полимер может быть предсказано использованием размерности массива. Вода угол контакта (WCA) измерений WCA измерений, сделанных с использованием метода сидячие падение наавтоматизированные Крюс DSA 100 инструментов. Одна капля воды объемом ~ 400 ФЛ обойтись использованием пьезо-управляемые печатающей головки на каждое пятно полимера. Диаметр пятна полимер, как правило, 300 мкм и диаметром основания капли воды на месте полимер, как правило, 100 мкм, таким образом, только одно измерение может быть получена в месте полимера. Этапе XY позволяет для автоматизированного позиционирования каждого пятна полимера под 7 печатающей головки. Это достигается с помощью камеры, расположенной над образцом, который обеспечивает вид сверху массива. Первоначально положение камеры должны быть скорректированы, чтобы выровнять дозирования капли воды к центру поля зрения камеры, а затем массив может быть совмещен с печатающей головкой. Высокая скорость камеры фиксирует боковой профиль капли при достижении поверхности, а затем испаряется. Кадр, который фиксирует начальное воздействие падения используется для измерения угла контакта. Круг устанавливается на падение профиле и угол контакта впоследствии определена. Время-пролетный вторичной ионной масс-спектрометрии (ToF-SIMS) Образец загружается на сцене. Это связано во-первых, выстилающих сцене с чистым Al фольга, которая помогает с зарядовой компенсации, а затем, удерживая на месте слайда с использованием вкладок металлический винт. Пример этапа помещается в передаче камере ToF-SIMS и позволило откачку до 1,6 × 10 -6 мбар. Затем образец передается в основную камеру анализа, который обычно имеет вакуумную давлении 1,0 × 10 -8 мбар. ToF-SIMS Измерения проводятся с использованием ION-TOF IV инструмента осуществляется с помощью моноизотопном Bi 3 + первичный источник ионов работать при 25 кВ в "пучки режиме". Импульсного 1 пА первичного пучка ионов развернут над анализом области, как с положительными и отрицательными вторичных ионов, полученная от 100 × 100 мкм, площадь каждого места полимера в микрочипов для 10-секундныйвторых приобретения времени. Ион массы определяли с помощью высоким разрешением по времени пролета анализатор, позволяющий точное назначение массы. Типичное разрешение по массе (в м / з 41) составила чуть более 6000. Электроны низкой энергии (20 эВ) были использованы для компенсации заряда поверхности вызвано положительно заряженные первичного пучка ионов на изоляционных поверхностях 8. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) Большой сцене AFM с автоматизированной этап необходим для анализа массивов на стекле. Измерение или ICON микроскоп идеально подходит для этой цели. Образец помещают на сцену и этап позиции адресами в верхнем правом углу массива. Положение в нижнем левом углу массива найден, который позволяет положение всех других местах следует интерполировать. Позиция список формируется и подается в автоматический отбор проб особенность программного обеспечения. АСМ измерения выполняются с использованием Наноскоп 3000A инструмент в освоении модае. Кремний советов с резонансной частотой около 300 кГц и силой постоянная 40 Н / м используются (Tap300Al, бюджет датчики). 5×5 регионов мкм полимера измеряют 9. Среднеквадратичное (RMS) шероховатость измеряется по всему региону для каждого изображения с помощью SPIP пакетной обработки программного обеспечения. Каждое изображение изначально плоской до шероховатости измерений. Все изображения требуют ручного просмотра изображений для выявления артефактов, которые, возможно, должны быть удалены из шероховатости измерений. На этом этапе изображения могут также быть классифицированы основанные на общих черт поверхности 9. Рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) Слайд микрочипов прикреплена к образцу бар с помощью двухсторонней ленты, а затем загружаются в образце камеры AXIS Ultra Кратос инструмента XPS. Вход в камеру для образца и подождите, пока он не достигнет давления ниже 10 -8 Торр. Соответствующую операциюпараметров, таких как монохроматизированном источника рентгеновского излучения (Al, 1486,6 эВ), потенциал анода и ток (10 кВ и 15 мА), размер диафрагмы (110μm), проход энергии (80 эВ для широкого сканирования и 20 эВ для высокого разрешения сканирования) являются выбрали. Источник рентгеновского излучения сосредоточена помощью двух противоположных углах микрочипов и оптимизации кислорода сигнал от образца. Х и у позициях отдельных пятен затем определяется и регистрируется как позиции списка. Программа графике написано, а затем запустить на приобретение данных, в том числе широкий сканирования и сканирование высокого разрешения для конкретных элементов. Спектроскопии комбинационного рассеяния света Спектров комбинационного рассеяния взяты для каждого пятна полимера с использованием рамановского микроскопа LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon). Первоначально комбинационного сигнала калибруется с помощью кремниевых пластин и рамановского сдвига Si на 520,7 см -1. Затем образец помещают на сцене, и в центре внимания лазера (длина волны = 523 нм), доводят до максимального CH рамановского сдвигапри 2950 см -1. Положение центра верхней левой пятно на микрочипе затем устанавливается, как происхождение и карта микрочипов является настройка с помощью функции массива на программное обеспечение labRAM HR. 10 спектров приобретенные в совокупности для каждого образца с временем облучения в 0,5 с. 5. Бактериальный анализ Массив может подвергаться воздействию различных биологических анализов, включая привязанность и пролиферации стволовых клеток, другие типы клеток и бактерий 3,10,4. Здесь мы опишем бактериального анализа привязанность, которая схематически показана на рисунке 4. Бактериального штамма, трансформированного GFP выразил плазмиды культивировали в течение ночи при 37 ° С в 10 мл LB среды в 50 мл трубки сокола при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. OD 600 бактериальной культуры измеряется и достаточно ночной культуры засевают в 15 мл RPMI-1640 определен СМИ, чтобы привестиВ окончательном OD 600 0,01. Массивы предварительно промывали в стерилизованной дистиллированной воде в течение 10 минут для удаления растворимых компонентов из массива (unpolymerised мономеров, олигомеров и растворителя) Промытые слайды массива помещаются в чистую чашку Петри и УФ стерилизуют в течение 10 мин. Слайдов с массивом помещают в чашку Петри и 15 мл прививку RMPI-1640 средств массовой информации не добавляется. Одновременно другой слайд помещают в чашку Петри и инкубировали с не-innoculatd RPMI-1640 в качестве контроля. Слайды инкубировали при 37 ° C в течение 72 часов при встряхивании при 60 оборотах в минуту. Слайды дважды промывают 15 мл стерильной PBS. Слайды дважды промывают 15 мл стерильной дистиллированной воды. Слайды сушат на воздухе. Слайды загружаются использованием GenePix Autoloader 4200AL Scanner (Molecular Devices, США) с 488 нм лазерного возбуждения и стандартных голубого свечения фильтр (510-560nm). Представитель полимера автофлуоресценции изображениепоказано на рисунке 2. Это должно быть сделано как можно скорее, чтобы избежать распада GFP. Если это не представляется возможным, клетки должны пройти фиксации. Кроме того, включение соответствующего положительного контроля с известными бактериальными ответа необходимо, чтобы иметь возможность нормализовать результаты и позволяют экспериментов, проведенных в разные дни, чтобы быть количественно сравнимы. Общая интенсивность флуоресценции от пятен полимера, приобретенный с помощью GenePix Pro 6 программного обеспечения (Molecular Devices, США). Это делается для слайдов инкубировали с бактериями и просто средства массовой информации. Чтобы найти флуоресценции за счет роста бактерий флуоресценции на контроль средства массовой информации вычитается из флуоресценции измеряли на слайде инкубировали с бактериями. Слайды также могут быть запятнана 20 мкМ SYTO17 нуклеиновые кислоты, красителей (Invitrogen, Великобритания) при комнатной температуре в течение 30 минут и отображаемого использованием Carl Zeiss LSM 700 лазерного сканирующего микроскопа с ZEN 2009 изображений программное обеспечение (Carl Zeiss, Германия). Покрытие бактерийна поверхности определяется с использованием открытых источников изображения J 1,44 программного обеспечения (Национальный институт здоровья, США). 6. Представитель Результаты Условия печати были оптимизированы для печати высокого качества микрочипов полимера. Влажность должна поддерживаться на уровне 30-40%. Отслоение пятна полимера в водной среде наблюдается часто для массивов печатных при влажности ниже 30%, предполагая, что эта влажность недостаточна, чтобы пополнить слой ПХЕМА и позволяют физический захват полимера на подложку. Влажность может быть увеличен еще на изменения диаметра пятна полимера, но это зависит от мономера химии. Например, при равных объемах полимеризации в растворе были напечатаны и как влажность была увеличена с 40 до 80% диаметра пятна уменьшился с 430 мкм до 370 мкм для мономера, содержащего гидрофильный этиленгликоля фрагмент равном объеме в то время для движенияНомер содержащие гидрофобные алифатического углерода кольцевой структуры диаметр пятна увеличилась с 290 мкм до 350 мкм (рис. 5). Степень полимеризации можно контролировать с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света для измерения С = С рамановского сдвига, обнаруженные при 1640 см -1, которые должны быть нормализованы с C = O рамановского сдвига при 1720 см -1. Спектров комбинационного рассеяния измерялась пятна полимера полимеризоваться для разнообразных ультрафиолетового облучения (рис. 6). C = C: C = O соотношение уменьшилось воздействия УФ-излучения возросла с 0 до 50 с, после чего не дальнейшее снижение C = C: C = O соотношение наблюдается с последующим облучением УФ (рис. 6). Спектров комбинационного рассеяния были также обнаружены на местах полимера полимеризации при разнообразных O 2 и C = C рамановского сдвига наблюдается как O 2 уровень был снижен до 2000 частей на миллион, однако никаких дальнейшее снижение наблюдалось O 2 уровня ниже (рис. 7A ). Спектроскопии комбинационного рассеяния также продемонстрировали способность вакуум-экстракции сТЭП для удаления неполимеризованных мономера. До вакуум-экстракции C = C рамановского сдвига была больше для полимера полимеризоваться при 3300 частей на миллион по сравнению с 2000 частей на миллион (рис. 7а), однако, после вакуум-экстракции высоты рамановского сдвига неотличимы (рис. 7В), предполагая, все мономера неполимеризованных был удален на стадии добычи вакуум. Подводя итог, условия полимеризации включают влажность 30-40%, УФ-облучения более 50 с при O 2 уровня ниже 2000 частей на миллион с шагом вакуум-экстракции после печати на 7 дней. После извлечения печати и вакуумные успех полимеризации пятна полимера может быть оценена простая световой микроскопии для выявления и аномальную морфологию месте. Как правило, пятна должны появиться круговые и форму, как показано на рисунке 8 слева. Вероятной причиной изменения геометрии поврежденных или нечистым PIN-код. Для небольшого числа мономеров комбинаций мы наблюдали деформированные места, для электроннойнапр центральное пятно со спутниковым небольших пятен, как показано на рисунке 8 на правой, или жареные яйца форму, где есть центральное место на вершине большие, плоские пятна. Это может быть вызвано разделение фаз перед печатью, связанные с различиями в вязкости, гидрофильности волатильности или поверхностное натяжение мономеров и предполагает, что мономер сочетание не совместимых с этим форматом. Дополнительное отображение химического полимера пятна такими методами, как ToF-SIMS также является важным, а иногда и необходимым шагом контроля качества, чтобы определить распределение химических материалов по пятнами и массива. Эта техника может идентифицировать чрезмерное распространение некоторых материалов не видны под световым микроскопом и определить разделения фаз в отдельных местах полимера. Рисунок 1. Схематическое изображающие различные этапы формирования роищейка месте. Рисунок 2. Схема методологии игольчатый матричный принтер с участием первоначальной загрузки штифт с мономера в исходной пластины, а затем нанесения мономера на подложку путем контакта. Контактный контролируется XYZ робота-манипулятора. На вставке показан типичный образ автофлуоресценции из массива после производства. Рисунок 3. Схема выделения методы, связанные с ВТСП, а также биопробы применены к изучению микрочипов полимера. Рисунок 4. Схема бактериального анализа вложений. Рисунок 5. PДиаметр olymer месте напечатаны в разнообразных влажности для двух различных мономеров: 4-трет-бутилциклогексил акрилата и ди (этиленгликоль) этиловый эфир метакрилата. Рисунок 6. Отношение интенсивности комбинационного для C = C рамановского сдвига при 1640 см -1 и C = O рамановского сдвига при 1720 см -1 от пятен полимер 4-трет-бутилциклогексил акрилата с различным воздействием УФ-излучения. Погрешности равны одно стандартное отклонение (n = 3). Рисунок 7. Спектров комбинационного рассеяния, измеренные для пятнами полимер 4-трет-бутилциклогексил акрилата напечатаны в разнообразных O 2 уровня, указанного слева от каждого спектра, (А) до и (б) после вакуум-экстракции. Отношение интенсивности комбинационного для C = C рамановского сдвига при 1640 см -1 и C = O рамановского сдвига при 1720 см -1 </suр> показано справа от каждого спектра. Рисунок 8. Светлый образ микроскопии два пятна полимера. Пятно слева показывает хорошо сформированы месте, в то время как пятно на правом является примером месте, содержащих очень неравномерно распределение мономера. Шкалы составляет 500 мкм.