Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

1. הכנת רקע עכירות נמוכות תשקול את 2 גרם של פולי (methacrylate hydroxyethyl) (pHEMA) (סיגמא – תרבות תאים נבדקה) לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. מתמוסס ב50 מ"ל של 95% (v / v) אתנול במים. זה בדרך כלל לוקח 24 שעות של sonication. טובלים-מעייל אפוקסי תפקודיות שקופיות זכוכית (Genetix) עם פתרון pHEMA. קבוצות אפוקסי תהיינה במהירות יוצרות קשרים קוולנטיים עם ציפוי pHEMA. טובלי ציפוי מושג על ידי מחזיק שקופיות זכוכית עם פינצטה, וטובל את השקופיות לפתרון. בדרך כלל 5 מ"מ של השקופית נותר ללא ציפוי, שהוא שימושי עבור orientating השקופית וגם יכול לשמש כביקורת חיובית כמשטח עמידה. אז השקופית נסוגה מפתרון pHEMA על פני תקופה של s 1, התהפכה והשאירה לייבוש בתנוחה כמעט אופקית למשך 10 דקות לפני הנחת בהחזיק שקופיות. את השקופיות המצופות pHEMA אז נעזבת בתנאים האטמוספריים ל1 שבוע כדי לאפשר לאידוי המלא של tהוא ממס. 2. הכנת תמיסת מונומר שוקל 120 מ"ג photoinitiator acetophenone 2,2-dimethoxy-2-פניל ולהוסיף 3 מ"ל של dimethylformamide (DMF) לעשות 4% (w / v) פתרון photoinitiator. הדבר נעשה טרי טוב ביותר לפני כל הדפסה, ולכן המסה והנפח של התמיסה יכולות להיות מגוונת כדי להתאים עד כמה פתרון photoinitiator נדרש. הפתרון הוא יציב עד לחודש. פתרוני מונומר נעשים על ידי הוספת חלק 1 מפתרון photoinitiator ל3 חלקים של מונומר המסודר. זו מושגת על ידי pipetting 5 μL של פתרון photoinitiator ו15 μL של מונומר לצלחת מקור 384 כן. נפח כולל של 20 μL הוא אידיאלי להיווצרות כתם. כמויות גבוהות יותר דורשות סופגות נוסף בטרם ניתן לייצר כתמים אחידים. נפחים קטנים יותר עלולים לגרום לטעינה מלאה של הסיכה. שיטה זו מוגבלת בשלב זה לשימוש במונומרים Acrylate נושאות / methacrylate שהם מסיסים בDMF ידי virtue של אלה להיות השילובים היחידים שנחקרו; acrylamides וממסים אחרים, סביר שיהיה נוח לתהליך ההדפסה. כדי להשיג את ריכוז מונומר הציע (75% w / w) מונומרים נוזליים נדרשים גם, אם כי ניתן להשתמש בו בריכוזים נמוכים מונומר למונומרים מוצקים (ריכוז מונומר המופחת אינו מופיע לרעה כדי לשנות את הכימיה של פני השטח של פולימר שנוצר אולם זה סביר להניח שהטמפרטורה במשקל וזכוכית המולקולרית המעבר משתנית). מונומרים מאוד תנודתיים גם קשה להשתמש בשל האידוי המהיר של מונומר לפני שלב הריפוי UV כאשר polymerising. תלוי במספר של פתרוני מונומר ריצה יכולה לקחת עוד 6 שעות ולקראת הסוף של מונומרים נדיפים אלו יופעלו שמתאדים מצלחת המקור. שימוש במונומרים נדיפים יכול להיות מושגת על ידי קירור ושלב ההדפסה באמצעות הדפסה קצרה פועלת רק. למעט כמה מונומרים הידרופילי ביותרכמו פולי (אתילן גליקול) Acrylate, הפירוק של כתמי פולימר התוצאה במאגרים מימיים לא נצפה, ולכן, השימוש במונומר crosslinking אינו נדרש, אם כי לא מן הנמנע. 3. היווצרות הפולימר microarray ההליך האופייני להיווצרות microarray פולימר מתואר סכמטי באיור 1. היווצרות microarray מושגת באמצעות רובוט מגע (Biodot) באמצעות שלב XYZ (איור 2). סיכות מחוררות בקוטר 220 מיקרומטר משמשות (Arrayit 96). כל הפינים יש לנקות על ידי sonication בdichloromethane במשך 10 דקות שקדמו למכבשי הדפוס וגם בעל הסיכה צריך גם לנקות. סיכות נטענות לתוך המחזיק, סופגת ושקופיות מערך נטענות ואז כל החדר מלא בארגון כדי להפחית את רמת החמצן אל מתחת לדקה 2000, שהוא נמוך מספיק, כדי למנוע מעיכה של רדיקלים פולימריזציה על ידי חמצן. הלחות היא maintaineד שבבין 30-40%. כולל לחות מאפשר לpHEMA להתנפח ומאפשר לפולימר נוצר לחדירה הדדית שכבת pHEMA ונלכד פיסיים למשטח 2. מכבשי הדפוס כלשהי. כל ריצה מורכבת מ: טוען מדגם מצלחת המקור. הפינים הורידו לפתרונים במהירות של 25 מ"מ / שני, שנערכה בפתרון של 2.5 ולאחר מכן נסוגו במהירות של 25 מ"מ / s (איור 2). פינים יש מחק לפני ההדפסה כדי להסיר פתרון מונומר מהחלק החיצוני של הפין. בהמשך משלוח מונומר מתרחש מחלק quilled של הסיכה להשיג היווצרות כתם עקבית. הרצף הסופג שימוש מורכב של 33 קשרים עם שקופית זכוכית נקיה. בארבעת המקומות הראשונים במספר אנשי הקשר שנעשו הוא 10, 5, 4 ו 3 בהתאמה. ארבעת העמדות 2 המגעים הקרובים נעשים ב3 העמדות האחרונות קשר 1 הוא עשה. זמן מגע כולל עבור כל איש קשר הוא 10 מילישניות וגישה ומהירות נסיגה הן 175מ"מ / s. בשלב הזה את הכתמים שנוצרו צריכים להיות צורה של גיאומטריה ועקבית. כישלון בשלב זה מציין סיכות נקיות או מזהם אבק בפתרוני מונומר. פתרוני מונומר אז מודפסים על גבי שקופיות זכוכית המצופית pHEMA (איור 2). קשר אחד עשה למקום בתנועת סיכה של 175 מ"מ / s ולפנות זמן של 10 אלפיות שני, שתלוי בצמיגות ואנרגית פני שטח של פתרון מונומר נותן קוטר נקודה ממוצעת של 400 מיקרומטר. בדרך כלל 3 מערכים לשכפל מודפסים על כל שקופית זכוכית וכוללת של 10 שקופיות מודפסים על ריצה אחת. זה משווה ל 30 נקודות בכל מחזור. פינים נשטפים בDMF. 2.5 ליטר של DMF הטרי מסופק לטווח לשטוף כולו. פינים רחצו באמבטית זרימה בהתרגשות רבה. במקביל לשטיפה, השקופיות המודפסות טרי הם מוקרנים במקור UV גל קצר (365 ננומטר) בצפיפות של 30/2 סנטימטר mV לאורכה של תקופת השטיפה שנמשכת 30 שניות. חרה כל פתרוני מונומר מודפסים המערכים הם מוקרנים עם UV (365 ננומטר) למשך 10 דקות נוספות. המערכים המודפסים טרי נשמרים בלחץ נמוך (<50 mTorr) עבור 1 שבוע להסיר מונומר unpolymerized וממס. 4. אפיון משטח תפוקה גבוה (HTSC) תכנית כללית של טכניקות HTSC מוצגת באיור 3. מרכזי לגישת התפוקה האוטומטית, הגבוהה הוא היישור של פולימר microarray עם מנגנון האפיון. בכל המקרים זה הושג ע"י שימוש במצלמה המאפשרת צפייה בנוף עליונה של המערך. בתחילה, המערך הוא מסובב לתיישר עם תנועת XY של הבמה. נקודת פינה של המערך אז ממוקם ומיועד קואורדינטות ספציפיות. המיקום של כל נקודת פולימר אז ניתן לחזות באמצעות ממדים של המערך. מים לתקשר זווית (אש"ל) מדידות מדידות WCA נלקחות בשיטת הטיפה הנייחת על100 מכשיר אוטומטי Krüss DSA. טיפת מים אחת בהיקף של 400 ~ PL חלק באמצעות ראש הדפסת piezo מונחה על כל כתם פולימר. קוטרו של כתם פולימר הוא בדרך כלל 300 מיקרומטר וקוטר הבסיס של טיפת מים על מקום הפולימר הוא בדרך כלל 100 מיקרומטר, ובכך, רק אחד מדידה ניתן להשיג בכל מקום פולימר. במת XY מאפשרת למיצוב האוטומטי של כל נקודת פולימר תחת 7 ראש ההדפסה. זו מושגת באמצעות מצלמה ממוקמת מעל לדוגמא שמספקת תצוגה עליונה של המערך. בתחילה, את מיקום המצלמה חייב להיות מותאם ליישור הוא הביטול של טיפת המים למרכז תצוגת המצלמה ואז המערך יכול להיות מיושר לראש ההדפסה. מצלמת מהירות גבוהה מתעדת את פרופיל הצד של רביב על להכות את פני שטח ולאחר מכן מתאדה. המסגרת שלוכדת את ההשפעה הראשונית של ירידה משמשת למדידת זווית המגע. המעגל מותאם לירידת Profile וזווית המגע ייקבעו בהמשך. בזמן של טיסה המשנית היון ספקטרומטריית (TOF-SIMS) מדגם הועמס על במה. זה כרוך ראשית בתור במה עם נקי אל רדיד, שמסייע בתשלום פיצוי, ולאחר מכן החזיק את השקופית במקום על ידי שימוש בכרטיסיות בורג מתכת. שלב דגימה מושם לתוך תא העברת TOF-SIMS ואפשר לשאוב למטה עד 1.6 × 10 -6 mbar. לאחר מכן הדגימה תועבר לחדר הניתוח הראשי, אשר בדרך כלל יש לחץ ואקום של 1.0 × 10 -8 mbar. מדידות TOF-SIMS מתבצעות באמצעות מכשיר רביעי ION-TOF מופעל באמצעות 3 Bi monoisotopic + מקור היון עיקרי פעל במהירות של 25 קילו וולט במצב "מכווץ". קורה פעם 1 רשות פלסטינית עיקרי יוני rastered מעל אזור הניתוח, עם יונים משניים חיוביים ושליליים שנאספו מ100 × 100 מיקרומטר אזור של כל נקודה בפולימר microarray ל10-secזמן רכישת ond. המוני יון נקבעו באמצעות מנתח ברזולוציה גבוהה בזמן של טיסה המאפשר הקצאת מסה מדויקת. רזולוצית המסה הטיפוסית (במ '/ z 41) הייתה קצת יותר מ 6000. אלקטרונים בעלי אנרגיה נמוכים (20 eV) שמשו כדי לפצות על משטח טעינה הנגרמת על ידי קרן היונים הטעונים חיובי העיקרית על משטחי בידוד 8. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) שלב AFM גדול עם שלב אוטומטי נדרש לניתוח מערכים על פני הזכוכית. מיקרוסקופ ממד או סמל הוא אידיאלי למטרה זו. דגימה מונחת על במה ועמדת הבמה התבייתה לפינה ימנית העליונה של המערך. העמדה בפינה השמאלית התחתונה של המערך נמצאה, המאפשר את המיקום של כל הנקודות האחרות שיש אינטרפולציה. רשימת עמדה נוצרה ומוזן לתכונה אוטומטית הדגימה של התוכנה. מדידות AFM נלקחות באמצעות מכשיר 3000 א Nanoscope בהקשת modדואר. טיפי סיליקון עם תדר תהודה של כ 300 kHz וכוח קבוע של 40 N / מ 'משמשים (Tap300Al, חיישני תקציב). אזורי מיקרומטר 5×5 של הפולימר נמדדים 9. שורש ממוצע חספוס מרובע (RMS) נמדד על פני אזור זה עבור כל תמונה באמצעות תוכנת עיבוד יצווה SPIP. כל תמונה בתחילה שטחה לפני מדידות חספוס. כל התמונות דורשות צפייה ידנית כדי לזהות חפצי הדמיה, שיתכן שיהיה צורך להסיר ממדידות חספוס. במהלך שלב זה תמונות עשויות גם להיות מסווגות המבוססת על תכונות פני שטח משותפות 9. רנטגן ספקטרוסקופיה Photoelectron (XPS) שקופית microarray מודבקת בר מדגם באמצעות סרט דו צדדי, ובהמשך נטענת לתוך תא מדגם XPS של מכשיר אולטרה ציר קרייטוס. להיכנס לחדר המדגם ולחכות עד שהיא מגיעה לחץ מתחת 10 -8 Torr. הניתוח המתאיםפרמטרים, כגון רנטגן מקור monochromated (אל, 1486.6 eV), האנודה פוטנציאל ונוכחי (10kV ו15mA), גודל צמצם (110μm), אנרגיה עוברת (80 eV לסריקה רחבה ו20 eV לסריקה ברזולוציה גבוהה) הם נבחר. מקור רנטגן מתמקד בשתי פינות מנוגדות של microarray ואופטימיזציה של אות החמצן מהמדגם. עמדות X ו-Y של כתמים בודדים לאחר מכן נקבעו ונרשמות כרשימת עמדה. תרשים תכנית כתוב ואז לרוץ לרכישת נתונים, לרבות סריקות נרחבות וסריקות ברזולוציה גבוהה לרכיבים ספציפיים. ראמאן ספקטרוסקופיה ספקטרום ראמאן נלקח על כל מקום פולימר באמצעות מיקרוסקופ ראמאן LabRAM HR (HORIBA Jobin Yvon). בתחילה, אות ראמאן היא מכוילת באמצעות פרוס סיליקון ומשמרת ראמאן של סי ב520.7 סנטימטר -1. אז המדגם מוצב על הבמה והמיקוד של הליזר (אורך הגל = 523 ננומטר) מותאם למקסם את משמרת ראמאן CHב2950 סנטימטר -1. מיקומו של המרכז במקום השמאלי העליון microarray יוגדר לאחר מכן כמוצא ומפה של microarray הוא התקנה באמצעות פונקצית המערך בתוכנת HR labRAM. 10 ספקטרומים רכשו במצטבר לכל דגימה בזמן הקרנה של 0.5 שניות. 5. בדיקת חיידקים המערך יכול להיות חשוף למבחנים ביולוגיים שונים לרבות התקשרות והתפשטות של תאי גזע, סוגי תאים אחרים וחיידקי 3,10,4. כאן אנו מתארים assay מצורף חיידקים, אשר מוצג סכמטי באיור 4. זן חיידקים הפך עם GFP פלסמיד הביע בתרבית הלילה על 37 מעלות צלזיוס ב10 מ"ל של תקשורת LB בצינור 50 מ"ל בז רועד ב 200 סל"ד. OD 600 של תרבות החיידקים נמדד ותרבות הלילה מספקת מחוסנת לתוך 15 המ"ל RPMI-1640 תקשורת מוגדרת כדי לגרוםבOD 600 של 0.01 סופי. מערכי prewashed במים מזוקקים מעוקרים במשך 10 דקות כדי להסיר את כל רכיבי dissolvable מהמערכים (מונומר unpolymerised, oligomers וממס) שקופיות מערך שטף הם הונחו בצלחת פטרי נקיה והמעוקרת UV למשך 10 דקות. שקופית עם המערך מושמת לתוך צלחת פטרי ו 15 מ"ל מ- 1640 RMPI התקשורת המחוסנת הוא הוסיף. במקביל שקופית אחרת מונחת בצלחת הפטר ודגרה עם הלא innoculatd RPMI-1640 כביקורת. שקופיות מודגרת על 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות עם רועד ב 60 סל"ד. שקופיות נשטפות פעמים עם 15 מ"ל של PBS סטרילית. שקופיות נשטפות פעמים עם 15 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים. שקופיות הן אוויר יבשות. הם צלמו שקופיות באמצעות סורק 4200AL autoloader GenePix (התקנים מולקולריים, ארה"ב) עם ליזר עירור 488 ננומטר ותקן פליטת מסנן כחול (510-560nm). תמונת autofluorescence נציג פולימר היאמוצג באיור 2. זה צריך להיעשות בהקדם האפשרי, כדי למנוע את ההתפרקות של ה-GFP. אם זה לא אפשרי בתאים צריכים לעבור קיבעון. יתר על כן, הכללת בקרות חיוביות מתאימות עם תגובת חיידקים ידועה היא הכרחית כדי שתוכל לנרמל את התוצאות וייאפשרו ניסויים שנערכו בימים שונים להיות כמותית דומה. עוצמת הקרינה הכוללת מכתמי פולימר היא רכשה באמצעות 6 Pro תוכנת GenePix (התקנים מולקולריים, ארה"ב). הדבר נעשה בשתי השקופיות מודגרות עם חיידקים ורק בתקשורת. כדי למצוא את הקרינה עקב צמיחה של חיידקי פלואורסצנטי בשלט המדיה נגרע מפלואורסצנטי נמדד בשקופית מודגרות עם חיידקים. שקופיות יכולות גם להיות מוכתמות על ידי צבע 20 מיקרומטר SYTO17 חומצות גרעין (Invitrogen, בריטניה) בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות וצלמו באמצעות מיקרוסקופ Carl Zeiss LSM 700 ליזר סריקה עם תוכנת ZEN 2009 הדמיה (Carl Zeiss, גרמניה). הכיסוי של חיידקיםעל פני השטח נקבע באמצעות שימוש בתוכנות קוד פתוחות 1.44 תמונת J (המכון הלאומי לבריאות, ארה"ב). 6. נציג תוצאות התנאים של הדפסת מוטבו כדי להדפיס את microarrays הפולימר באיכות הגבוהה ביותר. הלחות צריכה להיות כל זמן שבבין 30-40%. Delamination של כתמי פולימר בסביבות מימיות נצפה לעתים קרובות למערכים המודפסים בלחות מתחת 30%, מה שמרמז שלחות זו אינה מספיקה להתנפח שכבת pHEMA ולאפשר למלכודת הפיסית של הפולימר על המצע. הלחות ניתן להגדיל עוד יותר לשנות את הקוטר של כתמי הפולימר, אבל זה תלוי בכימית מונומר. לדוגמה, שבו נפחים שווים של פתרון פילמור הודפסו ולחות עלתה 40-80% קוטר נקודת ירד מ 430 מיקרומטר ל370 מיקרומטר למונומר המכיל אתילן גליקול תוך הידרופילי מחצית שווה נפח למוnomer המכיל פחמן טבעת מבנה אליפטי הידרופובי קוטר הנקודה עלה מ 290 ל 350 מיקרומטר מיקרומטר (איור 5). התואר של פילמור ניתן לנטר באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן למדוד C = C משמרת ראמאן שמתגלה ב1640 סנטימטר -1, שאמור להיות מנורמל עם C = שינוי O ראמאן ב1720 סנטימטר -1. ספקטרום ראמאן נמדד לכתמי הפולימר polymerized לחשיפה לקרינת UV מגוונים (איור 6). C = C: C = יחס O ירד כמו חשיפה לקרינת UV עלתה 0-50 של, ואז לא חל ירידה נוספת בC = C: C = יחס O נצפה עם קרינת UV נוספת (איור 6). ספקטרום ראמאן נמדדו גם לכתמי הפולימר polymerized ברמת 2 O המגוון וC = C משמרת ראמאן נצפתה כ2 רמת O צומצמה לדקת 2000, אולם אין ירידה נוספת נצפתה לרמת 2 O זה להלן (האיור 7 א ). ראמאן ספקטרוסקופיה גם הדגימה את היכולת של שאיבה של ואקוםטפ להסיר מונומר unpolymerized. לפני שאיבת הוואקום C = C משמרת ראמאן הייתה גדולה יותר עבור פולימר מפולמר ב3300 עמודים לדקה בהשוואה לדקה 2000 (איור 7 א), לעומת זאת, אחרי ואקום הגובה של משמרת ראמאן הוא נבדל (איור 7 ב), טוען כל מונומר unpolymerized הוסר במהלך שלב חילוץ הוואקום. לסיכום, תנאי פולימריזציה כוללים לחות של 30-40%, חשיפה של יותר מ 50 של UV ברמת 2 O מתחת לדקה 2000 עם צעד ואקום לאחר הדפסה למשך 7 ימים. לאחר חילוץ הדפסה וואקום ההצלחה של פילמור של כתמי פולימר ניתן להעריך על ידי מיקרוסקופיה לאור פשוט לזהות ומורפולוגיה הספוט חריגות. בדרך כלל, אמורים להופיע כתמים עגולים ואחידים, כפי שמוצגים באיור 8 בצד השמאל. הסיבה הסבירה לשינוי בגיאומטריה היא סיכה פגומה או לא נקיה. למספר קטן של שילובי מונומר שנצפינו כתמים מעוותים, לדוארxample מקום מרכזי עם לווין של נקודות קטנות, המוצגות באיור 8 בצד ימין, או צורת ביצה מטוגנת שבו יש מקום מרכזי בראש גדול, להחמיא במקום. זה יכול להיגרם על ידי הפרדת פאזות לפני הדפסה הנוגעת להבדלים במתח צמיגות, hydrophilicity, תנודתיות או פני שטח של מונומרים ומציע שילוב מונומר אינו תואם לפורמט זה. מיפוי כימי נוסף של כתמי פולימר על ידי טכניקות כגון TOF-SIMS הוא גם צעד בקרת איכות חשובה ולפעמים יש צורך לקבוע את החלוקה של chemistries של החומרים על פני הכתמים והמערך. טכניקה זו יכולה לזהות התפשטות מוגזמת של חומרים שאינם נראים על ידי מיקרוסקופ אור מסוים ולזהות שלב הפרדה בתוך כתמי פולימר בודדים. איור 1. סכמטי המתאר את השלבים השונים הכרוכים בהקמתה של פונקודת lymer. איור 2. סכמטי של המתודולוגיה של הדפסת סיכה המעורבת תחילה טעינת הסיכה עם מונומר בצלחת מקור ולאחר מכן הפקדת מונומר על מצע על ידי יצירת קשר. הסיכה נשלטת על ידי זרוע הרובוטית XYZ. ההבלעה מראה תמונה אופיינית של autofluorescence ממערך לאחר ייצור. איור 3. סכמטי הדגשת טכניקות הקשורות לHTSC וגם bioassays הוחל על המחקר של microarrays פולימרים. איור 4. סכמטי של assay מצורף החיידקים. איור 5. Pקוטר נקודת olymer מודפס בלחות מגוונת לשני מונומרים שונים: 4-טרט-butylcyclohexyl Acrylate נושאות וmethacrylate די (אתילן גליקול) אתיל אתר. איור 6. יחס עוצמת ראמאן עבור C = C משמרת ראמאן ב1640 סנטימטר -1 ו= משמרת ראמאן O C ב 1720 סנטימטר -1 מכתמי פולימר של Acrylate 4-טרט-butylcyclohexyl עם חשיפה לקרינת UV מגוונת. ברי שגיאת סטיית תקן אחת שווה (n = 3). איור 7. ספקטרום ראמאן נמדד כתמי פולימר של Acrylate 4-טרט butylcyclohexyl-המודפס ב 2 רמות O מגוונים, הצביע לשמאל לכל ספקטרום, () לפני ו( ב ') לאחר ואקום. היחס בין עוצמת ראמאן עבור C = C משמרת ראמאן ב1640 סנטימטר -1 והמשמרת = C O ראמאן ב1720 סנטימטר -1 </sup> מוצג לזכותו של כל ספקטרום. איור 8. תמונת מיקרוסקופ אור של שתי נקודתי פולימרים. הנקודה מהשמאל מראה מקום מעוצב היטב, בעוד הנקודה בצד ימין הוא דוגמה למקום שמכיל הפצה מאוד לא אחידה של מונומר. סרגל קנה המידה הוא 500 מיקרומטר.