Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

Ein. Herstellung von niedrig-Fouling Hintergrund Man wiegt 2 g Poly (hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA) (Sigma – Zellkultur getestet) in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Man löst in 50 ml 95% (v / v) Ethanol in Wasser. Dies dauert in der Regel 24 Stunden nach Beschallung. Dip-coat epoxyfunktionelle Glasobjektträger (Genetix) mit dem pHEMA Lösung. Die Epoxidgruppen rasch bilden kovalente Bindungen mit dem pHEMA Beschichtung. Tauchbeschichtung durch Halten des Glasobjektträger mit Pinzette und Eintauchen der Folie in die Lösung erzielt. Typischerweise 5 mm des Schiebers ist unbeschichtet, was nützlich ist, zur Ausrichtung der Folie und kann auch als eine positive Kontrolle als haftende Oberfläche handeln. Der Schieber wird dann aus dem pHEMA Lösung über einen Zeitraum von 1 s zurückgezogen, invertiert und links, in einer nahezu waagerechten Position für 10 min vor dem Einbringen in eine Gleithalter trocknen. Die pHEMA beschichtete Objektträger werden dann unter atmosphärischen Bedingungen für 1 Woche links, um die vollständige Verdampfung t erlaubenEr Lösungsmittel. 2. Herstellung Monomerlösung Wiegen 120 mg der Photoinitiator 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon und fügen den 3 ml Dimethylformamid (DMF), um ein 4% (w / v) Photoinitiator Lösung herzustellen. Dies geschieht am besten frisch gemacht, bevor Sie den Druck beginnen, so dass die Masse und das Volumen der Lösung aus variiert werden, um anzupassen, wie viel Photoinitiatorlösung erforderlich ist. Die Lösung ist stabil bis zu einem Monat. Monomerlösungen werden durch Zugabe von 1 Teil des Photoinitiator-Lösung auf 3 Teile des reinen Monomer hergestellt. Dies wird durch Pipettieren 5 ul Photoinitiator Lösung und 15 ul Monomer in einen 384-Well-Source-Platte erreicht. Ein Gesamtvolumen von 20 ul ist ideal für Spot-Bildung. Höhere Volumina erfordern zusätzliche Blotting vor einheitliche Spots produziert werden können. Kleinere Mengen können in unvollständiger Beladung des Stiftes führen. Dieses Verfahren wird derzeit für die Verwendung von Acrylat / Methacrylat-Monomeren, die löslich in DMF durch vi begrenztRTUE davon die einzigen Kombinationen, die untersucht worden sind, Acrylamide und anderen Lösungsmitteln sind wahrscheinlich zugänglich des Druckprozesses. Zur Erreichung der Monomerkonzentration vorgeschlagen (75% w / w) flüssige Monomere sind auch erforderlich, wenn auch geringeren Monomerkonzentrationen für feste Monomere verwendet werden können (die reduzierte Monomerkonzentration scheint nicht nachteilig verändern die Oberflächenchemie des resultierenden Polymers ist es jedoch wahrscheinlich, dass das Molekulargewicht und die Glasumwandlungstemperatur wird verändert). Leichtflüchtige Monomere sind auch schwierig auf Grund der schnellen Verdunstung des Monomers vor zu verwenden, um die UV-Härtung Schritt bei der Polymerisation. Abhängig von der Anzahl der Monomerlösungen ein Lauf solange 6 Stunden und gegen Ende der Laufzeit flüchtigen Monomere nehmen kann, wird von der Quellenplatte verdampft. Verwendung von flüchtigen Monomere können durch Abkühlen der Druckvorstufe und mit kurzen Auflagen nur dann erreicht werden kann. Mit Ausnahme einiger weniger stark hydrophilen Monomerenwie Poly (ethylenglycol) acrylat, die Auflösung der resultierenden Polymer-Spots in wässrigen Puffern wurde nicht beobachtet, so ist die Verwendung eines vernetzenden Monomers nicht erforderlich, obwohl nicht ausgeschlossen ist. 3. Polymer Microarray Bildung Die typische Vorgehensweise für Polymer Microarray Bildung ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Microarray Bildung wird durch eine Berührung Roboter (Biodot) mit einem XYZ Stufe (Abbildung 2). Spannstifte von 220 Mikrometer Durchmesser verwendet werden (Arrayit 96B). Alle Pins sollten durch Beschallung in Dichlormethan für 10 Minuten vor dem Auflagendruck und ebenso die Pin-Halter sollte auch gereinigt werden gereinigt werden. Stifte werden in den Halter geladen ist, Blotting und Array Folien eingelegt und dann die gesamte Kammer ist mit Argon gefüllt, um den Sauerstoffgehalt auf unter 2000 ppm, der ausreichend niedrig, um Quenchen der Polymerisation Reste durch Sauerstoff zu vermeiden. Die Luftfeuchtigkeit ist maintained bei 30-40%. Einschließlich Feuchtigkeit ermöglicht die pHEMA anzuschwellen Berücksichtigung des gebildeten Polymers die pHEMA Schicht durchdringen und sich physikalisch an der Oberfläche 2 eingeschlossen. Die Auflage ist begonnen. Jeder Lauf besteht aus: Lädt Probe von Source-Platte. Die Stifte werden in die Lösungen mit einer Geschwindigkeit von 25 mm / s, in Lösung für 2,5 s gehalten abgesenkt und dann zurückgezogen bei einer Geschwindigkeit von 25 mm / s (Abbildung 2). Stifte müssen vor der Ausgabe auf Monomerlösung von der Außenseite des Zapfens zu entfernen geblottet. Anschließend Monomer Lieferung erfolgt aus dem quilled Teil des Stiftes, um konsistente Spot-Bildung zu erreichen. Das Blotting Sequenz verwendet besteht aus 33 Kontakte mit einem sauberen Objektträger aus Glas. Für die ersten vier Positionen die Anzahl der Kontakte hergestellt ist 10, 5, 4 bzw. 3 dargestellt. Die nächsten vier Positionen 2 Kontakte geknüpft und in den letzten 3 Positionen 1 Kontakt hergestellt ist. Insgesamt Kontaktzeit für jeden Kontakt ist 10 ms, Ansatz und Abzugsgeschwindigkeit beträgt 175mm / s. Von diesem Punkt die Flecken gebildet haben sollte eine einheitliche Form und Geometrie. Failure an diesem Punkt zeigt unsauberen Nadeln oder Staub Verunreinigung in den Monomer-Lösungen. Die Monomerlösungen werden dann auf den pHEMA beschichtete Glasobjektträger (Abbildung 2) gedruckt. Ein Kontakt wird pro Spot an einem Pin Bewegung von 175 mm / s durchgeführt und Kontaktzeit von 10 ms, die in Abhängigkeit von der Viskosität und Oberflächenspannung der Monomerlösung ergibt eine durchschnittliche Fleckdurchmesser von 400 um. Typischerweise 3 replizieren Arrays sind auf jedem Objektträger gedruckt und insgesamt 10 gleitet auf einem einzigen Durchlauf gedruckt. Dies entspricht 30 Punkten pro Zyklus. Pins werden in DMF gewaschen. 2,5 l frischem DMF wird für den gesamten Wasch Lauf bereitgestellt. Pins sind in einem Flow Bad mit Agitation gewaschen. Gleichzeitig mit dem Waschen werden die frisch bedruckte Objektträger mit einer kurzwelligen UV (365 nm)-Quelle mit einer Dichte von 30 mV / cm 2 für die Dauer der Periode, die der Wäsche 30 s dauert bestrahlt. Aach alle Monomerlösungen gedruckt die Arrays mit UV (365 nm) werden für weitere 10 min bestrahlt. Die druckfrische Arrays werden bei niedrigem Druck (<50 mTorr) für 1 Woche gehalten, um unpolymerisierten Monomeren und Lösungsmittel zu entfernen. 4. Hoher Durchsatz Charakterisierung von Oberflächen (HTSL) Ein allgemeines Schema der HTSL-Techniken ist in Abbildung 3 dargestellt. Zentral für die automatisierte, Hochdurchsatz Ansatz ist die Ausrichtung des Polymers Microarray mit der Charakterisierung Vorrichtung. In allen Fällen wird durch eine Kamera, die eine Draufsicht des Arrays gibt. Anfänglich ist die Anordnung gedreht wird, um mit der XY-Bewegung der Bühne auszurichten. Eine Ecke Stelle des Array wird dann entfernt und bezeichnet bestimmte Koordinaten. Die Position jedes Polymer Spot kann dann unter Verwendung der vorhergesagten Abmessungen des Arrays werden. Wasser Randwinkel (WCA) Messungen WCA Messungen durchgeführt werden unter Verwendung der Methode des liegenden Tropfens auf einerautomatisierte Krüss DSA 100 Instrument. Eine einzelne Wassertropfen mit einem Volumen von ~ 400 pL abgegeben wird unter Verwendung eines piezogetriebenen Druckkopf auf jedem Polymer Spot. Der Durchmesser eines Polymers Ort ist typischerweise 300 um und der Basisdurchmesser des Wassertropfens auf dem Polymer Ort ist typischerweise 100 um somit nur eine Messung pro Polymer Ort erhalten werden können. Einen XY-Tisch ermöglicht die automatisierte Positionierung jedes Polymer Stelle unter dem Druckkopf 7. Dies wird erreicht durch eine Kamera oberhalb der Probe, die eine Draufsicht auf die Anordnung bietet gelegen. Zunächst muss der Kameraposition verstellt, um die Abgabe des Wassertropfens auf die Mitte der Kameraansicht auszurichten und dann das Array kann zu dem Druckkopf auszurichten. Ein Hochgeschwindigkeits-Kamera das Seitenprofil des Tröpfchens beim Auftreffen auf die Oberfläche und anschließendes Eindampfen. Der Rahmen, der die anfängliche Wirkung der Tropfen erfasst wird verwendet, um den Kontaktwinkel zu messen. Ein Kreis wird auf den Rückgang profi ausgestattetle und der Kontaktwinkel anschließend bestimmt. Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry (ToF-SIMS) Die Probe wird auf die Bühne geladen. Dies beinhaltet zunächst säumen die Bühne mit sauberen Al-Folie, die mit Ladungsausgleich hilft, und dann hält die Folie an Ort und Stelle durch die Verwendung von Metall-Schraube Registerkarten. Probentisch in die Schleusenkammer der ToF-SIMS gegeben und zu pumpen, bis 1,6 × 10 -6 mbar. Die Probe wird dann auf die Hauptanalyse Kammer, die typischerweise einen Vakuumdruck von 1,0 × 10 -8 mbar übertragen. ToF-SIMS Messungen werden durchgeführt unter Verwendung eines Ionen-ToF IV Instrument betrieben Verwendung eines monoisotopische Bi 3 + Primärionenquelle bei 25 kV im "gebündelten Mode" betrieben. Gepulster 1 pA primären Ionenstrahls über dem Analysebereich gerastert, mit positiven und negativen Sekundärionen von einem 100 × 100 um Fläche jedes Polymer Fleck in dem Mikroarray für eine 10-Sekunden gesammeltzweiten Messzeit. Ion Massen wurden mit einer hohen Auflösung Time-of-Flight-Analysator ermöglicht genaue Masse Zuordnung. Der typische Massenauflösung (bei m / z 41) knapp über 6000. Niederenergetischen Elektronen (20 eV) wurden verwendet, um für Oberflächen Ladung durch die positiv geladene primären Ionenstrahls auf den isolierenden Oberflächen 8 zu kompensieren. Atomic Force Microscopy (AFM) Eine große Bühne AFM mit einem automatisierten Stufe wird zum Analysieren der Arrays auf dem Glasobjektträger erforderlich. Eine Dimension oder ICON-Mikroskop ist ideal für diesen Zweck. Die Probe wird auf der Bühne platziert und Bühne Position auf rechten oberen Ecke des Arrays referenziert. Die Position der unteren linken Ecke des Arrays gefunden wird, ermöglicht, die die Position aller anderen Spots zu interpolieren. Eine Position Liste erzeugt und in das Auto-Sampling-Funktion der Software. AFM Messungen durchgeführt werden mit einem Nanoscope 3000A Instrument bei der Erschließung modE. Siliziumspitzen mit einer Resonanzfrequenz von etwa 300 kHz und einer Kraftkonstante von 40 N / m verwendet werden (Tap300Al, Budget-Sensoren). 5×5 um Regionen des Polymers werden 9 gemessen. Der root mean square (RMS) Rauheit in dieser Region wird für jedes Bild mit SPIP Stapelverarbeitung Software gemessen. Jedes Bild wird zunächst abgeflacht vor Rauheitsmessungen. Alle Bilder erfordern eine manuelle Betrachtung zur Bildgebung Artefakte, die müssen von Rauheitsmessungen entfernt werden, zu identifizieren. Während dieses Schrittes Bilder können auch auf der Grundlage gemeinsamer Oberflächenmerkmale 9 kategorisiert werden. Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS) Ein Mikroarray Folie wird auf eine Probe bar mit doppelseitigem Klebeband befestigt und anschliessend in die Probenkammer aus einem Kratos Achse ultra XPS Instrument geladen. Geben Sie in den Probenraum und warten, bis es einen Druck unter 10 -8 Torr erreicht. Die entsprechende OperationParameter, wie beispielsweise ein monochromatischer Röntgenquelle (Al, 1486,6 eV), Anodenpotential und Strom (10kV und 15mA) sind Öffnungsgröße (110μm), Durchgangsenergie (80 eV für breiter Strahlschwenkung und 20 eV für Auflösungsscan) ausgewählt ist. Die Röntgenquelle fokussiert ist mit zwei gegenüberliegenden Ecken des Mikroarrays und Optimierung der Sauerstoff Signals von der Probe. Die x-und y-Positionen der einzelnen Spots wird dann bestimmt und aufgezeichnet als Positionsliste. Ein Programm chart geschrieben und führen Sie dann für die Erfassung von Daten, einschließlich Breitbild-Scans und Scans in hoher Auflösung für bestimmte Elemente. Ramanspektroskopie Raman-Spektren werden für jedes Polymer vor Ort mittels einer Raman-Mikroskop LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon) aufgenommen. Anfänglich wird das Raman-Signal unter Verwendung eines kalibrierten Siliziumwafer und die Raman-Verschiebung von Si bei 520,7 cm -1. Die Probe wird dann auf der Stufe angeordnet, und der Fokus des Lasers (Wellenlänge = 523 nm) wird eingestellt, um die Raman-Verschiebung CH maximierenbei 2950 cm -1. Die Position der Mitte der oberen linken Stelle auf dem Mikroarray wird dann als Ursprung und einer Karte des Mikroarrays eingestellt ist Setup mit dem Array-Funktion auf der LabRAM HR-Software. 10 Spektren sind kumulativ für jede Probe mit einer Belichtungszeit von 0,5 s erworben. 5. Bakterielle Assay Die Anordnung kann auf viele verschiedene biologische Tests einschließlich der Anhaftung und der Proliferation von Stammzellen, andere Zelltypen und Bakterien 3,10,4 ausgesetzt werden. Hier beschreiben wir ein bakterielles Befestigung Assay, das schematisch in 4 gezeigt. Ein Bakterienstamm mit GFP transformierte Plasmid exprimiert wird über Nacht bei 37 ° C in 10 ml LB-Medium in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen unter Schütteln bei 200 UpM. Die OD 600 der Bakterienkultur wird gemessen und ausreichende Übernachtkultur wird in 15 ml RPMI-1640 definierten Medien inokuliert zu führenin einer endgültigen OD 600 von 0,01. Arrays werden in sterilisiertem destilliertem Wasser für 10 Minuten vorgewaschen, um alle löslichen Bestandteile aus den Arrays (unpolymerisierten Monomer, Oligomere und Lösungsmittel) entfernen Washed array Objektträger sind in einem sauberen Petrischale und UV für 10 min sterilisiert platziert. Eine Folie mit dem Array in eine Petrischale und 15 ml der inokulierten RMPI-1640 Medium gegeben wird hinzugefügt. Gleichzeitig ein weiterer Schieber in eine Petrischale gegeben und inkubiert mit nicht innoculatd RPMI-1640 als Kontrolle. Objektträger werden bei 37 ° C für 72 Stunden unter Schütteln bei 60 Upm inkubiert. Objektträger werden zweimal mit 15 ml steriler PBS gewaschen. Objektträger werden zweimal mit je 15 ml sterilem destilliertem Wasser gewaschen. Slides sind luftgetrocknet. Folien abgebildet werden unter Verwendung einer GenePix Autoloader 4200AL Scanner (Molecular Devices, USA) mit einem 488 nm Laser und Standard Anregung blaue Emission Filter (510-560nm). Ein Vertreter Polymer Autofluoreszenzbildes istin 2 gezeigt. Dies sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um den Zerfall des GFP zu vermeiden. Wenn dies nicht möglich die Zellen sollten unterziehen Fixierung. Weiterhin ist die Aufnahme geeigneter positive Kontrollen mit bekanntem bakterielle Reaktion zwingend in der Lage sein, um die Ergebnisse zu normalisieren und erlauben Experimenten an verschiedenen Tagen durchgeführt, um vergleichbare quantitativ. Die Gesamtmenge Fluoreszenzintensität aus Polymer Flecken erfasst mithilfe GenePix Pro 6 Software (Molecular Devices, US). Dies ist für die beiden Schlitten mit Bakterien und nur Medien inkubiert getan. Um die Fluoreszenz aufgrund des Wachstums von Bakterien finden, die Fluoreszenz auf dem media control wird von der Fluoreszenz auf der Folie mit Bakterien inkubiert gemessenen Werten abgezogen. Dias können auch durch 20 uM SYTO17 Nukleinsäurefarbstoff (Invitrogen, UK) bei Raumtemperatur für 30 Minuten gefärbt und bebildert mit einem Carl Zeiss LSM 700 Laser Scanning Mikroskop mit ZEN 2009 Imaging-Software (Carl Zeiss, Deutschland). Die Berichterstattung von Bakterienauf der Oberfläche wird mit Open-Source-Image J 1,44 Software (National Institute of Health, USA). 6. Repräsentative Ergebnisse Die Bedingungen des Buchdrucks wurden optimiert, um die höchste Qualität Polymers Microarrays drucken. Die Luftfeuchtigkeit sollte bei 30-40% gehalten werden. Das Polymer Stellen in wässrigen Umgebungen wurde häufig für Arrays bei einer Luftfeuchte unter 30% beobachtet gedruckten Delaminierung, was darauf hindeutet, dass diese ausreicht, um die Feuchtigkeit pHEMA Schicht aufquellen und erlauben die physikalischen Einschluss des Polymers auf dem Substrat ist. Die Feuchte kann weiter erhöht werden, um den Durchmesser der Polymerteilchen Spots verändern, aber dies hängt von der Monomer Chemie. Wo zum Beispiel gleiche Volumina Polymerisationslösung gedruckt wurden und als Feuchtigkeit wurde erhöhte sich von 40 bis 80% der Fleckdurchmesser von 430 um bis 370 um für eine verringerte Monomer, das eine hydrophile Gruppierung Ethylenglykol gleichen Volumens, während er bei monomer enthaltend eine hydrophobe aliphatische Kohlenstoff Ringstruktur der Fleckdurchmesser von 290 um bis 350 um (5) erhöht. Der Polymerisationsgrad kann überwacht unter Verwendung der Raman-Spektroskopie, die C = C Ramanverschiebung, die bei 1640 cm -1 festgestellt wird, die mit der C = O Ramanverschiebung bei 1720 cm -1 normalisiert werden soll messen. Die Raman-Spektren wurde für Polymer-Spots für unterschiedliche UV-Bestrahlung (6) polymerisiert gemessen. Die C = C-C = O-Verhältnis verringert, wie UV-Belichtung von 0 bis 50 s erhöht wird, worauf keine weitere Abnahme der C = C-C = O-Verhältnis wurde mit weiteren UV-Bestrahlung (6) beobachtet. Raman-Spektren wurden auch für Polymer-Spot in unterschiedlichen O 2-Gehalt und der C = C Ramanverschiebung beobachtet als die O 2-Niveau zu 2000 ppm gesenkt wurde, jedoch keine weitere Reduktion wurde für einen O 2-Niveau unterhalb dieser beobachtet (Abbildung 7A polymerisiert gemessene ). Raman-Spektroskopie zeigte auch die Fähigkeit der Vakuumextraktionsleitung step um unpolymerisierten Monomer zu entfernen. Vor Vakuumextraktionsleitung die C = C Ramanverschiebung größer für das Polymer bei 3300 ppm im Vergleich zu 2000 ppm (7A) polymerisiert wurde, aber nach Vakuumextraktionsleitung die Höhe der Ramanverschiebung ununterscheidbar (7B), was nahe legt alle unpolymerisierten Monomer während das Vakuum Extraktionsschritt entfernt. Zusammenfassend umfassen Polymerisationsbedingungen eine Feuchtigkeit von 30-40%, UV-Belichtung von mehr als 50 s bei einem O 2-Niveau unter 2000 ppm mit einem Vakuum Extraktionsschritt nach dem Drucken für 7 Tage. Nach dem Drucken und Vakuumextraktion der Erfolg der Polymerisation von Polymer Spots können durch einfache Lichtmikroskopie zu identifizieren und anomale Morphologien Spot beurteilt werden. Normalerweise sollte Flecken kreisförmigen und gleichmäßig, wie in Abbildung 8 auf der linken Seite angezeigt. Die wahrscheinliche Ursache für eine Änderung der Geometrie ist ein beschädigtes oder unrein Pin. Für eine kleine Anzahl von Monomer-Kombinationen haben wir unförmig Flecken beobachtet wird, für EXample eine zentrale Stelle mit einem Satelliten von kleinen Flecken, in Abbildung 8 auf der rechten Seite dargestellt, oder einem gebratenen Ei-Form, wo es um einen zentralen Platz an der Spitze der großen, flacheren Stelle. Dies kann durch Phasentrennung vor dem Drucken in Bezug auf Unterschiede in der Viskosität, Hydrophilie, Flüchtigkeit oder Oberflächenspannung der Monomeren und legt nahe, dass das Monomer-Kombination ist nicht kompatibel mit diesem Format verursacht werden. Zusätzliche chemische Abbildung der Flecken Polymer durch Techniken wie ToF-SIMS ist auch ein wichtiger und manchmal notwendig Qualitätskontrolle Schritt, um die Verteilung der Materialien Chemien für die Flecken und der Anordnung zu bestimmen. Diese Technik kann identifizieren übermäßige Ausbreitung von manchen Materialien nicht sichtbar durch Lichtmikroskopie und identifizieren Phasentrennung innerhalb einzelner Polymer Flecken. Abbildung 1. Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte bei der Bildung einer po involviertLymer Ort. Abbildung 2. Schematische der Methodik von Stift-Druck mit ersten Einlegen der Stift mit Monomer in einer Quellenplatte und dann Abscheiden des Monomers auf ein Substrat, indem ein Kontakt. Der Stift wird durch einen XYZ Roboterarm gesteuert. Der Einschub zeigt ein typisches Bild der Autofluoreszenz aus einem Array nach der Produktion. Abbildung 3. Schematische Hervorhebung der Techniken mit HTSL und Bioassays angewendet auf das Studium der Polymer Mikroarrays zugeordnet. Abbildung 4. Schematische Darstellung des bakteriellen Anlage Assay. Abbildung 5. P4-tert-Butylcyclohexylacrylat und Di (ethylenglycol) ethylether Methacrylat: olymer Fleckdurchmesser in unterschiedlichen Feuchtigkeit für zwei verschiedene Monomere gedruckt. Abbildung 6. Das Verhältnis der Raman-Intensität für die C = C Ramanverschiebung bei 1640 cm -1 und der C = O Ramanverschiebung bei 1720 cm -1 von Polymer Stellen aus 4-tert-Butylcyclohexylacrylat mit verschiedenen UV-Exposition. Die Fehlerbalken gleich eine Standardabweichung (n = 3). Abbildung 7. Die Raman-Spektren für das Polymer Stellen aus 4-tert-Butylcyclohexylacrylat in unterschiedlichen Ebenen O 2 gedruckt, gemessen angedeutet links von jedem Spektrum, (A) vor und (B) nach Vakuumextraktion. Das Verhältnis der Raman-Intensität für die C = C Ramanverschiebung bei 1640 cm -1 und der C = O Ramanverschiebung bei 1720 cm -1 </sup> befindet sich rechts von jedem Spektrum gezeigt. Abbildung 8. Eine lichtmikroskopische Aufnahme von zwei Polymeren Flecken. Der Fleck auf der linken Seite zeigt eine wohlgeformte Ort, während die Stelle auf der rechten Seite ist ein Beispiel für einen Ort mit einer sehr ungleichmäßig Verteilung der Monomer. Der Maßstab beträgt 500 um.