Évaluer hypermutation somatique dans les cellules B Ramos, après surexpression ou Knockdown de gènes spécifiques
Summary
Nous décrivons comment effectuer des infections rétrovirales ou lentiviraux de la surexpression ou de shRNA contenant des constructions dans les cellules B humaines Ramos en ligne et comment mesurer hypermutation somatique dans ces cellules.
Abstract
Les cellules B commencent leur vie avec des anticorps de faible affinité générés par V (D) J. Toutefois, après la détection d'un pathogène, la variable (V) la région d'une immunoglobuline (Ig) gène est muté environ 100.000 fois plus que le reste du génome grâce à hypermutation somatique (SHM), résultant de l'affinité des anticorps 1,2 de haut. De plus, la commutation isotypique (CSR) produit des anticorps avec les différentes fonctions effectrices selon le type de réponse immunitaire qui est nécessaire pour un agent pathogène particulier. Tant en matière de RSE et la SHM sont initiées par la cytidine désaminase induite par activation (AID), qui désamine résidus cytosine dans l'ADN pour produire uraciles. Ces uraciles sont traitées par des formes d'erreurs des voies de réparation, pour aboutir finalement à des mutations et recombinaisons 1-3.
Notre compréhension actuelle des détails moléculaires de SHM et la RSE proviennent d'une combinaison d'études chez la souris, des cellules primaires, lignées cellulaires et des cellules-fexpériences ree. Des modèles murins reste l'étalon-or avec des KO génétique montrant des rôles essentiels pour de nombreux facteurs de réparation (par exemple Ung, MSH2, MSH6, Exo1, et la polymérase η) 4-10. Cependant, tous les gènes sont susceptibles d'études à élimination directe. Par exemple, KO de plusieurs double-brin de protéines de réparation des cassures sont embryonnaire létal ou altérer développement des cellules B 11-14. D'ailleurs, parfois la fonction spécifique d'une protéine dans SHM ou RSE peuvent être masqués par plusieurs défauts mondial causé par les huitièmes de finale. En outre, depuis les expériences chez la souris peut être long, en modifiant l'expression des gènes individuels dans des lignées cellulaires est devenu une étape plus populaire d'abord identifier et caractériser les gènes candidats 15-18.
Ramos – une ligne de lymphome de Burkitt qui subit constitutivement SHM – a été un populaire lignée cellulaire modèle pour étudier SHM 18-24. Un avantage de cellules Ramos, c'est qu'ils ont un semi intégré pratique-Quantitative mesure de SHM. Cellules de type sauvage d'exprimer des IgM et, comme ils prennent des mutations, certaines mutations assommer l'expression d'IgM. Par conséquent, le dosage de la perte d'IgM par la numérisation des cellules activées par fluorescence (FACS) fournit un moyen rapide de lecture pour le niveau de SHM. Une mesure plus quantitative de la SHM peut être obtenu par séquençage direct des gènes d'anticorps.
Comme les cellules Ramos sont difficiles à transfecter, nous produisons des dérivés stables qui ont augmenté ou abaissé expression d'un gène particulier en infectant les cellules avec des constructions rétrovirales ou lentiviraux qui contiennent soit une cassette surexpression ou une épingle à cheveux courts ARN (shRNA), respectivement. Ici, nous décrivons comment nous infecter les cellules Ramos et ensuite utiliser ces cellules pour étudier le rôle des gènes spécifiques sur SHM (figure 1).
Protocol
Discussion
Comme indiqué précédemment, les modèles de la lignée cellulaire pour la diversification des anticorps sont devenus un point de départ pour identifier de nouvelles protéines qui influencent les différentes étapes au cours de diversification des anticorps. Nous présentons ici une méthode pour utiliser une infection virale à des protéines soit le knock-down ou une surexpression dans les cellules B Ramos ligne et ensuite d'examiner l'impact sur la SHM.
Pour ces études, nous…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le pMSCV-AID-I-Thy1.1 et pKat2 vecteurs ont été un cadeau aimable de la DG Schatz et l'pVSV-G, pRSV-Rev, et pMDLg / pRRE vecteurs ont été un cadeau du genre BR Cullen.
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
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