Summary

Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen

Published: November 01, 2011
doi:

Summary

We beschrijven hoe retrovirale of lentivirale infecties van overexpressie of shRNA-bevattende constructies in het menselijk Ramos B-cellijn en hoe somatische hypermutatie te meten in deze cellen. Uit te voeren

Abstract

B-cellen beginnen hun leven met een lage affiniteit antilichamen gegenereerd door V (D) J recombinatie. Echter, bij het ​​opsporen van een ziekteverwekker, is de variabele (V) regio van een immunoglobuline (Ig) gen ongeveer 100.000 keer meer dan de rest van het genoom door middel van somatische hypermutatie (SHM) gemuteerd, wat resulteert in een hoge affiniteit antilichamen 1,2. Daarnaast, klasse switch recombinatie (CSR) produceert antilichamen met verschillende effector functies, afhankelijk van de aard van de immuunrespons die nodig is voor een bepaalde ziekteverwekker. CSR en SHM worden geïnitieerd door de activatie-geïnduceerde cytidinedeaminase (AID), die cytosine residuen in DNA te produceren uracils deaminates. Deze uracils worden verwerkt door foutgevoelige vormen van reparatie wegen, uiteindelijk leidend tot mutaties en recombinatie 1-3.

Onze huidige kennis van de moleculaire details van de SHM en MVO komen uit een combinatie van studies in muizen, primaire cellen, cellijnen, en cel-free experimenten. Muismodellen blijft de gouden standaard met genetische knockouts tonen cruciale rol voor vele reparatie factoren (bijvoorbeeld Ung, MSH2, MSH6, Exo1, en ​​polymerase η) 4-10. Echter, niet alle genen zijn vatbaar voor de knock-out studies. Bijvoorbeeld, knockouts van verschillende double-strand break repair eiwitten embryonaal dodelijk of aantasting B-cel ontwikkeling 11-14. Bovendien, soms de specifieke functie van een eiwit in SHM of MVO kan worden gemaskeerd door de meer globale defecten veroorzaakt door de knock-out. Daarnaast kan worden omdat experimenten in muizen langdurig, veranderen van de expressie van individuele genen in cellijnen is uitgegroeid tot een steeds populairder eerste stap naar het identificeren en karakteriseren kandidaat-genen 15-18.

Ramos – een Burkitt lymfoom cellijn die constitutief ondergaat SHM – is een populaire cellijn model om SHM 18-24 te bestuderen. Een voordeel van Ramos cellen is dat ze een ingebouwde handige semi hebben-Kwantitatieve meting van SHM. Wild-type cellen brengen IgM en, als ze pick-up mutaties, een aantal van de mutaties knock-out IgM expressie. Daarom is het testen van IgM verlies door fluorescentie-geactiveerde cel scanning (FACS) biedt een snelle uitlezing voor het niveau van de SHM. Een meer kwantitatieve meting van de SHM kan worden verkregen door direct sequencing het antilichaam genen.

Omdat Ramos-cellen zijn moeilijk te transfecteren, produceren we stabiele derivaten die zijn verhoogd of verlaagd expressie van een individueel gen door het infecteren van cellen met retrovirale of lentivirale constructen die ofwel een overexpressie cassette of een short hairpin RNA (shRNA), respectievelijk bevatten. Hier beschrijven we hoe we dan Ramos cellen te infecteren en het gebruik van deze cellen om de rol van specifieke genen op de SHM (figuur 1) te onderzoeken.

Protocol

1. Voorbereiding van de monsters en cellen Voer een middelgrote schaal bereiding van DNA (midiprep) van de overexpressie of shRNA-bevattende constructen en de retrovirale vector verpakking pKat2 of de lentivirale vectoren verpakking pVSV-G, pMDLg / pRRE, en pRSV-Rev 25. Gebruik 6 pg DNA per bouwen en een 4 ug van pKat2 (voor retrovirale infecties) of 1,5 ug DNA voor elk van de pVSV-g, pMDLg / pRRE, en pRSV-Rev verpakking vectoren (voor lentivirale infecties). Bereid BOSC 23 media. Voor tr…

Discussion

Zoals eerder besproken, hebben cellijn modellen voor antilichaam diversificatie uitgegroeid tot een populaire uitvalsbasis om nieuwe eiwitten die verschillende stappen invloed tijdens antilichaam diversificatie te identificeren. We presenteren hier een methode voor het gebruik van virale infectie van beide knock-down of overexpressie eiwitten in de Ramos B-cellijn en vervolgens onderzoekt de impact op de SHM.

Voor deze studies maken we gebruik van zowel WT Ramos en AID hi Ramos ce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De pMSCV-AID-I-Thy1.1 en pKat2 vectoren werden een soort geschenk van DG Schatz en de pVSV-G, pRSV-Rev, en pMDLg / pRRE vectoren werden een soort geschenk van BR Cullen.

Materials

Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
6-well clear TC-treated plates Corning 3516  
10 mL BD Luer-Loksyringes BD Medical 309604  
24-well clear TC-treated plates Corning 3526  
96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates Corning 3596  
100 mm TC-treated culture dishes Corning 430167  
Acrodisc syringe filters, 0.45 μm Pall Life Sciences 4604  
Agar Teknova A7777  
Agarose GeneMate E-3120-500  
Ampicillin Sigma A0166 100 mg/mL in water
BD FACSCanto II flow cytometer BD Biosciences   or similar
BD Falcon round bottom polystyrene tubes BD Biosciences 352054 for FACS
BOSC 23 cells ATCC CRL-11270  
CO2 incubator capable of 37°C      
DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) Sigma D6429  
FBS (fetal bovine serum) Gemini Bio-Products 100-106  
FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody BioLegend 202503 FITC α-Thy1.1
FuGENE 6 Transfection Reagent Roche 11814443001  
HEPES buffer solution Invitrogen 15630-080  
KAPA HiFi DNA polymerase KAPA Biosystems KK2101  
LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder Difco 240230  
MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock Sigma   shRNA vectors
NCS (newborn calf serum) Gemini Bio-Products 100-504  
PBS (phosphate buffered solution) Invitrogen 70011 diluted to 1x in water
PE α-human IgM antibody BioLegend 314508  
PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) Gemini Bio-Products 400-110  
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma 107689 10 mg/mL in water
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495  
Puromycin Sigma P8833 250 μg/mL in water
QIAquick gel extraction kit QIAGEN 28706  
Ramos (RA 1) cells ATCC CRL-1596  
RPMI-1640 medium Sigma R8758  
SuperScript II Invitrogen 18064-022  
SYBR FAST qPCR kit KAPA Biosystems KK4601  
Taq DNA Polymerase Invitrogen 18038-042  
TOPO TA Cloning kit Invitrogen K4520-01  
TRIzol Invitrogen 15596-026  
Wizard SV Genomic DNA purification system Promega A2361  
X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] Growcells C-5687 40 mg/mL in DMSO

References

  1. Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
  2. Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
  3. Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
  4. Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
  5. Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
  6. Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
  7. Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
  8. Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
  9. Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
  10. Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
  11. Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
  12. Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
  13. Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
  14. Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
  15. Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
  16. Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
  17. Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
  18. Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
  19. Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
  20. Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
  21. Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
  22. Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
  23. Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
  24. Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
  25. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
  26. Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
  27. Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).

Play Video

Cite This Article
Upton, D. C., Unniraman, S. Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes. J. Vis. Exp. (57), e3573, doi:10.3791/3573 (2011).

View Video